梁桂洪 黄和涛 潘建科 曾令烽 杨伟毅 罗明辉 杨园 陈红云 韩燕鸿 赵金龙 刘军

摘 要 目的：探索龍鳖胶囊含药血清（后文简写为“LBJN”）对Yes结构结合蛋白（YAP）抑制剂维替泊芬（verteporfin）诱导软骨细胞凋亡的保护作用及机制。方法：通过两步酶消化法提取原代人膝骨性关节炎软骨细胞，利用甲苯胺蓝染色法和Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色法对细胞进行鉴定。采用流式细胞术检测2、5 μmol/L verteporfin单用和分别与5%LBJN联用48 h后对细胞凋亡的影响，并设置溶剂对照[0.1%二甲基亚砜（DMSO）]和5%LBJN对照。采用Western blot法检测0.1%DMSO（溶剂对照）、2 μmol/L verteporfin、2 μmol/L verteporfin+5%LBJN和0（空白对照）、2.5%LBJN、5%LBJN处理48 h后细胞中凋亡相关蛋白[YAP、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、活化胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3）]的表达水平;采用Western blot法检测0（空白对照）、2.5%、5%LBJN处理48 h后细胞中自噬相关蛋白[哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Beclin-1、LC3A/B ]的表达水平。结果：分离出的细胞符合软骨细胞的特征。与0.1%DMSO比较，2、5 μmol/L verteporfin作用后细胞的凋亡率均显著升高（P<0.05），且两个浓度的作用效果相当（P>0.05）;与单用verteporfin比较，2、5 μmol/L verteporfin与5%LBJN联用后细胞的凋亡率均显著降低（P<0.05）。与0.1%DMSO比较，2 μmol/L verteporfin作用后细胞中YAP、Bcl-2蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），而cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;与2 μmol/L verteporfin比较，2 μmol/L verteporfin+5%LBJN作用后细胞中YAP、Bcl-2蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05），而cleaved-caspase-3蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）。与空白对照比较，2.5%、5%LBJN作用后细胞中YAP、Bcl-2、Beclin-1蛋白的表达水平和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ比值均显著升高（P<0.05），而cleaved-caspase-3、mTOR蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）。结论：LBJN具有阻断YAP抑制剂verteporfin诱导的软骨细胞凋亡的作用，其机制可能与调节软骨细胞中凋亡相关蛋白的表达和增强软骨细胞的自噬有关。

关键词 龙鳖胶囊;含药血清;骨性关节炎;软骨细胞;Yes结构结合蛋白抑制剂;凋亡;自噬

ABSTRACT   OBJECTIVE： To explore the protective effects of Longbie capsule contained serum （called “LBJN” for short） on the apoptosis of chondrocytes induced by YAP inhibitor verteporfin and its mechanism. METHODS： Primary human knee osteoarthritis（OA） chondrocytes were extracted by two-step enzymatic digestion， and then identified by toluidine blue staining and type Ⅱ collagen immunofluorescence staining. The effects of 2， 5 μmol/L verteporfin alone or combined with 5%LBJN on cell apoptosis were detected by flow cytometry. Solvent control（0.1% DMSO） and 5% LBJN were set. Western blot assay was adopted to detect the expression of apoptosis related proteins （YAP， Bcl-2， cleaved-caspase-3） after treated with 0.1%DMSO （solvent control）， 2 μmol/L verteporfin， 2 μmol/L verteporfin+5%LBJN和0（blank control）， 2.5% LBJN and 5% LBJN for 48 h. The expression of autophagy related proteins （mTOR， Beclin-1， LC3A/B） after treated with 0（blank control）， 2.5%， 5% LBJN for 48 h were detected by Western blot assay. RESULTS： The isolated cells accorded with the characteristics of chondrocytes. Compared with 0.1%DMSO， the apoptosis rates of cells were increased significantly after treated with 2， 5 μmol/L verteporfin （P<0.05）， and the effects of the two concentrations were similar （P>0.05）. Compared with verteporfin alone， 2， 5 μmol/L verteporfin combined with 5%LBJN could significantly decrease the apoptotic rate of cells （P<0.05）. Compared with 0.1%DMSO， the protein expression of YAP and Bcl-2 were decreased significantly after treated with 2 μmol/L verteporfin （P<0.05）， while the protein expression of cleaved-caspase-3 were increased significantly（P<0.05）. Compared with 2 μmol/L verteporfin， protein expression of YAP and Bcl-2 were increased significantly after treated with 2 μmol/L verteporfin+5%LBJN （P<0.05）， while the protein expression of cleaved-caspase-3 were decreased significantly（P<0.05）. Compared with blank control， the protein expression of YAP，Bcl-2 and Beclin-1 were increased significantly after treated with 2.5%， 5%LBJN （P<0.05）， while protein expression of cleaved-caspase-3 and mTOR were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： LBJN can block the apoptosis of chondrocytes induced by YAP inhibitor verteporfin， and its mechanism may be related to regulating the expression of apoptosis related proteins and enhancing autophagy of chondrocytes.

KEYWORDS   Longbie capsule; Contained serum; Osteoarthritis; Chondrocytes; YAP inhibitor; Apoptosis; Autophagy

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨的破坏性改变为主要病理特征的慢性退行性疾病[1]。软骨细胞发生凋亡是导致关节软骨退变的主要因素，因此抑制软骨细胞凋亡是缓解软骨退变的有效途径[2]。Yes结构结合蛋白（YAP）是Hippo信号通路下游的效应因子，同时也是转录共激活因子，其不仅能参与调节细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等各项生物学行为，而且还能以不同的方式调控软骨细胞的成熟和分化，并能维持软骨细胞的软骨表型[3-4]。……