刘 佩，陈 澄，秦新光，张海枝，胡中泽，吴 琼，姚人勇，王学东，刘 刚,4,*

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.纽迪希亚制药（无锡）有限公司，江苏 无锡 214000；3.中粮米业（岳阳）有限公司，湖南 岳阳 414100；4.武汉轻工大学 湖北省农产品加工与转化重点实验室，湖北 武汉 430023）

乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）是奶酪工业的副产物，蛋白质含量在90%以上，其具有人体所需的全部必需氨基酸，营养价值极高。因此，WPI被广泛应用于食品与药品中，而其在食品中的作用主要是作为饮料、冰淇淋、蛋黄酱等乳化型食品的表面活性剂[1-3]。WPI与大多数蛋白质类似，对环境中pH值、温度、盐离子浓度的变化非常敏感，这些因素也会导致蛋白质变性聚集[4]。

近年来国内外研究学者为解决蛋白质对外界环境敏感的问题，提高蛋白质的乳化性能进行了大量研究，方法有对蛋白质进行修饰、糖基化改性、形成聚集体等，例如姚玉静等[5]制备了磷酸化大豆分离蛋白，研究发现其溶解性、乳化能力和持水性均明显提高；Liu Gang等[6-7]报道了WPI与乳糖通过糖基化结合后在pH 2.0的条件下加热会使蛋白质形成纳米纤维，此时蛋白质形成纤维状聚集体，这种由糖基化WPI形成的纳米纤维拥有更高的疏水性，并且制备的乳液也更稳定；王金梅[8]对大豆蛋白的热聚集行为进行研究，通过控制pH值和加热温度调控大豆蛋白的聚集形态，与天然大豆蛋白相比其聚集体稳定的乳液界面蛋白含量、离子强度耐受性和pH值稳定性均有改善，而且拥有较高的热稳定性。目前已有大量文献表明，通过改变蛋白质存在环境可以形成不同的聚集体：在酸性条件下（pH≤2.0）进行热处理（＞80 ℃），蛋白质的结构会发生去折叠现象，使更多的疏水基团外露，蛋白质大分子由于疏水相互作用、范德华力、分子间作用力等多种因素而发生聚集行为，导致蛋白质分子进行重新排列和交叉，从而形成了纤维状聚集体[9-10]；在pH值靠近等电点时对蛋白质进行热处理（＞80 ℃），由于肽链构象改变而造成的蛋白质高级结构去折叠，受疏水相互作用的主导并伴随着氢键和二硫键的作用，蛋白质分子之间相互连接形成球状聚集体[11]。

Pickering乳液是以固体颗粒直接吸附在油-水界面上形成抗聚结的稳定乳液。相较于传统乳液，Pickering乳液除具有传统乳液的功能特性之外，其利用固体颗粒稳定乳液不仅降低了体系的自由能，为液滴之间提供了良好的界面机械屏障，保护了乳液液滴形态，使乳液更加稳定，而且具有粒径分布可控、低毒性、制备方法简单等诸多优点[12]。研究表明，Pickering乳液的稳定性受离子强度、pH值、固体颗粒形状、浓度等因素的影响。例如Mikulcová等[13]研究了pH值对羧基化纤维素纳米晶形成水/油性乳液的影响，发现乳化性能主要受连续相的pH值影响；Zhu Yuqing等[14]通过改变制备条件中的pH值、离子强度、含油量，利用小麦醇溶蛋白制得一种流变性能可控的乳液凝胶。蛋白质颗粒由于具有两亲性质及营养价值成为制备食品级Pickering乳液的重要原料，且主要的研究方向集中在对蛋白质颗粒进行修饰和糖基化改性，但是对蛋白质不同聚集体的理化性质及其Pickering乳液稳定性的研究却鲜有报道。

本实验通过改变环境的pH值热诱导WPI形成纤维状聚集体和球状聚集体，探究原蛋白与聚集体的结构特性（微观结构、Zeta电位）和乳化特性（乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI））的差异，分析蛋白质结构的变化与乳化特性的关系。研究不同pH值、盐离子浓度、温度条件对Pickering乳液乳化特性和粒径分布的影响，以期为蛋白质聚集体稳定Pickering乳液在乳饮料中的应用奠定一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

WPI（蛋白含量96.88%） 美国Hilmar Ingredients公司；中链甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT）武汉远诚科技发展有限公司；氯化钠、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FE20实验室pH计、ME104E电子分析天平 梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；C-MAG HS10恒温磁力搅拌器、T18型高速分散仪 德国IKA工业设备集团；UV-1000紫外-可见分光光度计 翱艺仪器（上海）有限公司；Zetasizer Nano-ZS马尔文激光粒度仪、Mastersizer 3000激光粒度仪 英国马尔文仪器有限公司；CX40光学显微镜 舜宇光学科技（集团）有限公司；Libra 200MC型透射电子显微镜 蔡司光学仪器（上海）国际贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI聚集体的制备

用超纯水配制质量浓度5 mg/mL的WPI溶液，室温下磁力搅拌2 h使其充分溶解。取3 份上述WPI溶液，记为1号、2号、3号。将1号和2号溶液调至pH 7.0，3号溶液调至pH 2.0。然后，将1号溶液置于室温下磁力搅拌12 h，2号和3号溶液置于85 ℃油浴锅中加热搅拌12 h。2号和3号取出后立即冷却至室温。最后将三者置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 WPI纤维状聚集体和球状聚集体的形貌表征

分别用pH 2.0、7.0的去离子水稀释WPI溶液到质量浓度为0.5 mg/mL。移取少量样品至铜网上吸附20 min，使用滤纸对铜网进行干燥处理，运用透射电镜在100 kV电压下观察并拍照。

1.3.3 Zeta电位的测定

分别调节1.3.1节中制得的WPI、纤维状聚集体和球状聚集体溶液至pH 2.0～7.0，使用Malvern Nano-ZS型激光粒度仪测定Zeta电位。

1.3.4 Pickering乳液的制备及其EAI的测定

参考Pearce[15]与崔珊珊[16]等的方法测定EAI。以WPI溶液作为水相，MCT作为油相，将水相和油相以质量比1∶1混合，使用高速分散机于室温、20 000 r/min处理1 min制得乳液。室温静置2 h使蛋白颗粒充分吸附到油水界面上，取底部液体10 μL，并用质量浓度为1 mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液稀释至1 mL。充分混匀后，利用紫外-可见分光光度计测其500 nm波长处的吸光度。乳化性用EAI表示，其计算公式如下：

式中：T=2.303；A500nm为乳液在波长500 nm处的吸光度；C为蛋白质质量浓度/（g/mL）；φ为油相所占体积分数（φ=1/2）；n为稀释倍数（n=100）。

1.3.4.1 pH值对WPI及其聚集体乳化性能的影响

分别将3 种WPI溶液调至pH 4.0～9.0，以上述不同pH值梯度蛋白溶液制备Pickering乳液并测定EAI。

1.3.4.2 盐离子浓度对WPI及其聚集体乳化性能的影响

取3 种WPI溶液分别调至pH 7.0，加入NaCl使其盐离子浓度分别为0、50、100 mmol/L，以上述不同盐离子蛋白浓度溶液制备Pickering乳液并测定EAI。

1.3.5 Pickering乳液的微观结构

取Pickering乳液乳化层少量，稀释一定的倍数，分散均匀后取10 μL分散液进行制片，在光学显微镜下观察乳液的微观形貌并拍照分析。

1.3.6 Pickering乳液的粒径分析

使用Malvern Mastersizer 3000激光粒度仪分别测定Pickering乳液的粒径大小及其粒径分布情况（测试时取乳化层）。参数为：颗粒吸收率为0.001，颗粒折射率为1.450，分散剂折射率为1.330，密度为0.945。

1.3.7 热稳定性分析

取3 种WPI溶液，并分别调至pH 7.0，分别置于室温（25 ℃）、65、85 ℃和105 ℃加热15 min，取出冷却至室温后，再对Pickering乳液进行粒径分析。

1.4 数据统计

2 结果与分析

2.1 WPI纤维状聚集体和球状聚集体的形貌表征

使用透射电子显微镜观察在不同pH值下制备的WPI聚集体的微观形貌，结果如图1所示。在pH 2.0时，WPI溶液经85 ℃加热处理12 h，WPI颗粒的形貌呈纤维状聚集（图1A），这与朱连昌[17]的报道较为一致。对于蛋白质纤维状聚集的作用机理已有广泛报道，普遍认为蛋白质去折叠过程是形成纤维状聚集的关键[18]。黄颖等[19]报道了β-乳球蛋白纤维状聚集体产生过程中的形貌变化，发现加热初期β-乳球蛋白粒子分散性更好，而加热2 h后蛋白质开始呈纤维状聚集。而在pH 7.0时，WPI经85 ℃加热处理12 h后呈现球状聚集（图1B），与图1A形成完全不同的形貌。这2 种聚集体的形成主要是由于不同酸热条件，蛋白质分子间发生疏水相互作用以及形成二硫键。不仅这2 种聚集体的形貌迥异，而且会表现出截然不同的界面性质[20]。

图1 WPI聚集体的透射电镜图像Fig.1 TEM pictures of WPI and its aggregates

2.2 WPI不同聚集体Zeta电位随pH值的变化情况

根据图2所示，2 种聚集体的Zeta电位随pH值的变化趋势与WPI相似，总体呈现随pH值的增大而减小的趋势，且Zeta电位均存在显著差异（P＜0.05）。同时，可以看出2 种聚集体的等电点相较于WPI均发生了右移，其中纤维状聚集体的等电点右移更为明显。在蛋白质等电点附近（pH 5.0）时，WPI聚集体的Zeta电位绝对值明显小于原蛋白，这说明蛋白表面电荷的减少，造成这一现象的原因可能是在蛋白质聚集体形成的过程中，蛋白表面带电的氨基酸残基内收，从而降低了WPI在等电点附近的携带电荷的能力[21-22]。

图2 WPI、纤维状聚集体及球状聚集体的Zeta电位分析Fig.2 Zeta-potential of WPI, fibrous aggregates, and spherical aggregates

2.3 pH值对WPI聚集体乳化性能及其Pickering乳液的影响

2.3.1 pH值对WPI及其聚集体乳化性能的影响

EAI是蛋白质吸附到界面能力的量度[23-24]，是直接反映乳液性能的常用指标之一。从图3可知，pH值对WPI及其聚集体的EAI影响非常显著，整体上EAI随着pH值的增加呈现先减小后增大的趋势，且EAI均存在显著差异（P＜0.05）。在pH 5.0时，WPI及其聚集体的EAI值最低，这可能是因为蛋白质在等电点附近时，蛋白质的表面电荷几乎为0，溶解性最差，颗粒间的排斥作用减弱，吸附在乳液油水界面上的蛋白质最少，因此此时EAI值最低[25-26]。而在pH 4.0的条件下，WPI纤维状聚集体的EAI显著高于WPI和球状聚集体，达到（21.62±0.56）m2/g，这与2.2节中pH 4.0时纤维状聚集体的Zeta电位绝对值较大相一致，说明pH 4.0时纤维状聚集体的表面负载有更多的电荷，蛋白颗粒间排斥作用增强，吸附在油水界面上的蛋白质增加，导致此时EAI值增大。

图3 pH值对WPI及其聚集体EAI的影响Fig.3 Effect of pH on EAI of WPI and its aggregates

2.3.2 不同pH值条件下Pickering乳液的微观结构

如图4所示，WPI原蛋白所制备的Pickering乳液对pH值的变化尤为敏感，乳液结构不稳定，乳滴形状不均一且易破乳。但2 种聚集体制备的Pickering乳液具有稳定的乳液结构，均可形成大小较为均一的球状液滴，这可能是因为纤维状聚集体与球状聚集体的形成增强了蛋白表面的疏水性，这样的颗粒在油-水界面上的吸附性更强，毛细管力更大，所形成的Pickering乳液液滴均一，稳定性也越好[27]。

图4 不同pH值条件下Pickering乳液微观结构Fig.4 Microstructures of Pickering emulsions under different pH conditions

2.4 盐离子浓度对WPI聚集体乳化性能及其Pickering乳液粒径的影响

2.4.1 盐离子浓度对WPI及其聚集体乳化性能的影响

如图5所示，WPI和球状聚集体的EAI均呈现先增大后减小的趋势，这表明低浓度的盐离子有助于提高WPI及其球状聚集体的乳化活性，这可能是因为低浓度盐离子存在时，水的结构发生改变，蛋白溶解度降低但不至于聚集[28]，进而加强了其乳化性能；当NaCl浓度达到100 mmol/L时，蛋白质的EAI相较于0 mmol/L时变化不大，可能是因为过高的NaCl浓度使蛋白质表面电位降低，盐离子会导致蛋白质之间的交联，同时产生静电屏蔽作用。值得注意的是，纤维状聚集体乳化性能受盐离子浓度影响不显著（P＞0.05），在0、50、100 mmol/L的条件下分别为（18.02±1.08）、（18.33±1.14）、（18.00±0.83）m2/g，原因可能是在形成纤维状聚集体的过程中，带电的氨基酸残基的空间位点发生了改变，使其乳化性能不易受盐离子浓度影响。

图5 NaCl浓度对WPI及其聚集体EAI的影响Fig.5 Effect of NaCl concentration on E AI of WPI and its aggregates

2.4.2 盐离子浓度对Pickering乳液粒径的影响

图6A～D反映WPI及其聚集体稳定Pickering乳液的粒径变化情况。由图6B、D可以看出，在0、50、100 mmol/L的盐离子浓度下，纤维状聚集体稳定的Pickering乳液，其粒径分布图的3 条曲线几乎重合，乳液的平均粒径也几乎不受盐离子浓度影响，显示了粒径受盐离子浓度影响不显著（P＞0.05），这说明纤维状聚集体稳定的Pickering乳液有良好的盐离子耐受性。这也与纤维状聚集体良好的乳化性能有关，由于纤维状聚集体在两相界面上的吸附能力对盐离子浓度变化并不敏感，造成了其Pickering乳液具有较好的稳定性[29]。由图6A、C和D可知，盐离子浓度对WPI与球状聚集体稳定的Pickering乳液的平均粒径影响显著（P＜0.05），乳液粒径均会在NaCl浓度50 mmol/L时减小，在NaCl浓度100 mmol/L时增大，这可能是由于盐离子的加入起到静电屏蔽的作用，增加了蛋白颗粒的表面疏水性，而低浓度的盐离子又不至于使其聚集，从而小幅度地降低了乳液粒径。同时，球状聚集体本身的疏水性要强于WPI，当乳液中盐离子浓度到达100 mmol/L后，其受静电屏蔽的影响大于原蛋白，从而导致了乳液平均粒径的增幅较大[30]。

根据图6A、B、C对比可知，盐离子的添加引起纤维状聚集体和球状聚集体稳定Pickering乳液的粒径分布曲线的峰强变强，乳液更加均一，这可能是因为添加了盐离子后，水的结构和分子排列发生改变、颗粒在界面上的分布更有序。

图6 NaCl浓度对Pickering乳液粒径分布的影响Fig.6 Effect of NaCl concentration on particle size distribution of Pickering emulsions

2.5 热稳定性分析

在食品生产加工过程中不可避免会进行热处理。因此，必须研究温度对蛋白质乳液体系的影响，而乳液的粒径则是评判乳液性质的重要参数。由图7可以看出，经过热处理后，WPI及其聚集体所制得的Pickering乳液粒径分布良好。图7A显示经过热处理后WPI稳定的Pickering乳液的峰强增强，说明热处理提高了其稳定性；图7B显示纤维状聚集体稳定的Pickering乳液峰强也有增强的趋势，但是在65 ℃处理后峰宽加大，峰强减小，这是因为WPI纤维状聚集体的蛋白分子质量大，较低的加热温度便足以使其分子之间发生聚集，从而使乳液平均粒径增大、均一性下降；图7C显示球状聚集体稳定的Pickering乳液在加热处理后峰强均减小，特别是在85 ℃时不仅峰强下降程度更深，峰宽也加大，这说明在85 ℃处理后，乳液的粒径差别较大、且分布不均匀。

图7 处理温度对Pickering乳液粒径分布的影响Fig.7 Effect of different treatment temperatures on particle size distribution of Pickering emulsions

从图7D可知，WPI及其聚集体在加热处理后其平均粒径均呈现先减小后增大的趋势，这可能是因为较低温度（65 ℃）的热处理使Pickering乳液的流动性增强、蛋白表面携带了正负电荷的基团发生中和，使颗粒表面变得柔顺，而当处理温度升高后（85、105 ℃），蛋白颗粒发生聚集，颗粒分散性有所下降，乳液的平均粒径也增大了[31]。并且原蛋白与纤维状聚集体稳定的Pickering乳液在105 ℃处理后发生大量聚集，平均粒径分别增至（55.5±0.76）μm与（45.2±1.02） μm。不仅如此，对不同处理温度后的Pickering乳液进行倒置宏观观察，纤维状聚集体稳定的Pickering乳液在105 ℃处理后，由于纤维状聚集体的交联使Pickering乳液出现明显的凝胶化，而球状聚集体稳定的Pickering乳液在整个过程中其平均粒径变化较小，加热处理后仍旧保持良好的流动性。虽然球状聚集体稳定的Pickering乳液的粒径分布情况并不理想，但其在热处理后平均粒径变化最小，且仍保持了良好的流动性，并未有明显凝胶结构的生成，所以球状聚集体稳定的Pickering乳液是原蛋白、纤维状聚集体、球状聚集体中稳定性最佳的。

3 结 论

本实验分别在pH 2.0和pH 7.0热处理制备WPI纤维状聚集体和球状聚集体，这2 种聚集体在形貌上具有截然不同的特点，表现出其不同的乳化性能和热稳定性。在pH 2.0～7.0时，WPI聚集体Zeta电位的变化趋势与原蛋白相似，均由携带正电荷逐渐变为带负电荷。在不同的pH值环境下，两种聚集体比原蛋白具有更好的乳化性能，并且由聚集体稳定的Pickering乳液在较广泛的pH值范围均能保持液滴的形态。在不同盐离子浓度下，纤维状聚集体的乳化性能几乎不受影响，并且所稳定的Pickering乳液也非常稳定。最后对WPI及其聚集体所稳定的Pickering乳液进行热稳定性分析，由聚集体稳定的Pickering乳液相较于WPI能够更好地抵御温度的变化。因此，WPI聚集体相较于WPI在外部环境变化中拥有更好的乳化性能以及稳定性，蛋白质聚集体的乳化与液滴结构的稳定性、耐温性等优势有望应用于食品和饮料等研究领域。