徐 璐，钱 峰，孙 磊

上海交通大学药学院细胞与治疗抗体工程研究中心，上海 200240

头颈癌是好发于人口腔、鼻腔、咽、喉等部位粘膜表面的鳞状细胞癌，据统计仅2018年就有超过90万新发病例，死亡人数超过40万，严重威胁人类健康［1-2］。目前，头颈癌的首选治疗手段是手术切除、放化疗［3］，但由于放射性治疗对人体存在的毒性反应，有20%～30%的患者无法完成整体放化疗过程［4］。对于中晚期并伴随局部淋巴结转移的头颈癌患者，寻找有效的抗头颈癌药物对于提高患者生存期及生活质量至关重要。三硫二苄基（DTS）是商陆科蒜香草（Petiveria alliacea L）中的一种主要活性成分［5］。该药用植物在民间被广泛运用于哮喘、关节炎、肿瘤等疾病的治疗［6］，现代药理研究证实其在各种中枢神经系统疾病中也具有明显疗效，例如焦虑、疼痛、记忆力减退和癫痫发作等，能够有效改善大脑认知、记忆和学习能力［6-7］。有研究显示DTS及其类似物能够抑制多种肿瘤细胞的增殖［8］，但DTS在头颈癌中的作用尚未报道。

抗凋亡是肿瘤细胞的一种恶性表型，目前多数肿瘤治疗策略与细胞凋亡信号通路激活相关［9］。线粒体介导的凋亡依赖于线粒体外膜上Bcl-2家族蛋白之间的相互作用以及细胞色素c的释放，从而促进一系列凋亡蛋白酶包括caspase-3的激活［10］；同时线粒体外膜通透性的增高也会导致线粒体去极化，造成线粒体膜电位降低以及凋亡因子释放［11］。已知PI3K/Akt信号通路广泛参与了多种癌症的发病机制，由生存因子诱导的Akt激活可以抑制细胞凋亡，调控细胞生长和分化［12］。p53是多种肿瘤的抑制因子，能够调控细胞周期，也是早期头颈癌常见的突变基因［13］。本研究阐明了DTS对头颈癌细胞HN30增殖和凋亡的影响，并对其作用机制作进一步探讨。

1 材料和方法

1.1 试剂

三硫二苄基（Cato Research Chemicals）（C14H14S3，MW：278.46，纯度≥98.0%，CAS：6493-73-8）；DMEM培养基、青霉素-链霉素双抗（100×）、胰酶（Thermo Fisher）；胎牛血清（浙江天杭生物）；结晶紫、MTT粉末（生工生物工程（上海））；Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒（杭州联科生物）；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天）；一抗β-actin，caspase-3，cleaved caspase-3，Bcl-2，p-Akt，Akt，p-p53，p53（Cell Signaling Technology）；人源头颈部鳞状癌细胞株HN30（美国菌种保藏中心）。

1.2 细胞培养

人源头颈部鳞状癌细胞株HN30、HN12和SCC25所用培养基为含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养。观察到细胞状态良好，于生长对数期进行胰酶消化、传代操作。

1.3 克隆形成实验

分别取处于对数生长期且状态良好的HN30、HN12和SCC25细胞，胰酶消化并离心收集，梯度稀释后以400/孔的细胞密度接种至六孔板，加入2 mL/孔的培养液以及相应浓度的DTS，37 ℃、5%CO2条件下培养7 d。待显微镜下观察到单个克隆点含有50及以上细胞，终止培养，弃上清，甲醇固定20 min，0.1%结晶紫染色，20 min后洗去染色液晾干拍照，克隆点计数。实验重复3次。

1.4 MTT实验

准确称量MTT 粉末并用无菌PBS 溶解，得到5 mg/mL的MTT溶液。收集处于对数生长期且状态良好的HN30细胞，梯度稀释后以1×103/孔的细胞密度接种至96孔板，过夜培养。每孔换新鲜培养液200 μL，并加入相应浓度的DTS孵育24 h。孵育结束，每孔加入20 μL5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h。弃上清，每孔加入100 μL DMSO，置于水平摇床上，震荡5～10 min，待孔内紫色沉淀充分溶解，酶标仪测定490 nm 处的A490nm。各组设6个复孔，实验重复3次。

1.5 凋亡检测

收集处于对数生长期且状态良好的HN30细胞，以4×105/孔的细胞密度接种至12孔板，过夜培养。每孔换新鲜培养液2 mL，并加入相应浓度的DTS孵育24 h。孵育结束，消化、收集细胞，冷PBS洗3遍。根据细胞凋亡检测试剂盒说明书，加入1×binding buffer重悬，转移至流式管中，加入FITC和PI染液避光孵育。流式细胞仪（LSRFortessaTMX-20；BD Biosciences）上机检测，结果通过Flowjo 7.6软件进行分析。实验重复3次。

1.6 线粒体膜电位检测

收集处于对数生长期且状态良好的HN30细胞，以4×105/孔的细胞密度接种至12孔板，过夜培养。每孔换新鲜培养液2 mL，并加入相应浓度的DTS孵育24 h。孵育结束，消化、收集细胞，冷PBS洗3遍。根据线粒体膜电位检测试剂盒说明书，配置JC-1染色工作液，避光孵育20 min后，离心，用JC-1染色缓冲液洗3遍，PBS重悬。流式细胞仪上机检测，结果通过Flowjo 7.6软件进行分析。实验重复3次。

1.7 Western blot 蛋白印迹分析

1.7.1 蛋白样品处理 将HN30细胞以1×106/孔的细胞密度接种至六孔板，贴壁后加入相应浓度的药物刺激。用RIPA裂解液裂解蛋白，根据BCA定量结果调齐蛋白浓度。

1.7.2 电泳及转膜 配置10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶。电压80 V至各孔样品跑齐，调整电压为120 V至样品跑到底。取出蛋白胶，按“纤维垫-滤纸-胶-膜-滤纸-纤维垫”的顺序放置，电压110 V 将蛋白转至硝酸纤维素（NC）膜上。转膜结束，取出NC膜，在5%的脱脂牛奶中室温封闭2 h。1×TNET buffer 洗膜，4 ℃下与对应的一抗孵育14 h，1×TNET buffer 洗膜。室温孵育二抗2 h，1×TNET buffer 洗膜。现配ECL 显影液，使用Bio-Rad 凝胶成像系统进行条带显色和拍照。实验重复3次。

1.8 统计学分析

本研究各实验均进行3次重复，数据结果以均数±标准差表示，作图与分析采用Graph Pad Prim 5软件，统计学差异比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DTS抑制头颈癌细胞增殖

克隆形成实验结果显示，DTS结构如图1A所示，在DTS刺激下，与溶剂对照组相比，不同头颈癌细胞株HN30、HN12和SCC25的增殖能力均被抑制，且随DTS浓度增加，克隆点的数目逐渐减少（图1B）。对HN30细胞的克隆点进行统计，1 μmol/L DTS 作用下，HN30 增殖几乎被完全抑制（图1C，P<0.001）。MTT实验结果显示，不同浓度DTS刺激HN30细胞24 h后，细胞活力显著降低（图1F，P<0.01），呈现剂量依赖性。

2.2 DTS诱导HN30细胞凋亡

DTS刺激HN30细胞24 h，凋亡细胞比例显著增多（图2A）。对第一象限及第四象限的凋亡细胞进行统计分析显示，DTS能够诱导HN30细胞凋亡，且具有剂量依赖性（P<0.05，图2B）。

2.3 DTS诱导HN30细胞线粒体膜电位降低

当细胞发生线粒体依赖性的早期凋亡，线粒体膜电位下降，JC-1探针由聚合物（红色荧光）转变为单体（绿色荧光）。在DTS刺激下，呈绿色荧光的细胞群体（右下）比例增多（图3A），对JC-1单体比例进行统计分析显示，随DTS浓度升高，JC-1单体比例逐渐增多（P<0.01，图3B）。

图3 DTS诱导HN30细胞线粒体膜电位降低Fig.3 DTS reduces mitochondrial membrane potential in HN30 cells.A:JC-1 fluorescent probe staining for detecting mitochondrial membrane potential of HN30 cells treated with 3,10,and 30 μmol/L DTS for 24 h;B:Percentages of JC-1 monomer cells.**P<0.01,***P<0.001 vs the solvent control group.

2.4 DTS调控HN30细胞凋亡相关蛋白表达

不同浓度的DTS刺激HN30细胞24 h后，caspase-3表达降低，有活性的cleaved caspase-3表达升高，而Bcl-2含量显著降低（图4A）。分别对caspase-3、cleaved caspase-3和Bcl-2的蛋白条带进行灰度分析，结果显示，DTS能够调控HN30细胞的凋亡信号通路，诱导凋亡蛋白酶cleaved caspase-3 的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（P<0.05，图4BC）。

图4 DTS调控HN30细胞凋亡相关蛋白表达Fig.4 DTS regulates the expression of apoptosis-related proteins in HN30 cells.A:Western blot analysis of the expression of caspase-3,cleaved caspase-3 and Bcl-2 in HN30 cells after treatment with DTS(3,10,30 and μmol/L)for 24 h.B,C:Quantification of the protein expressions.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs the solvent control group.

2.5 DTS能够抑制HN30细胞中Akt的磷酸化并激活p53通路

通过Western blot 检测Akt 及p53 蛋白的变化，10 μmol/L DTS 刺激HN30 细胞，在不同时间点检测HN30细胞Akt及p53的表达，结果显示，DTS刺激下，HN30 细胞Akt 磷酸化（Ser 473）降低，p53 磷酸化（Ser 15）增强，在16 h作用显著（图5A）。分别对Akt及p53的总蛋白水平和磷酸化水平进行灰度分析，结果显示，随着DTS作用时间延长，HN30细胞的Akt磷酸化被抑制，而p53磷酸化被激活（P<0.05，图5B、C）。

图5 DTS能够抑制HN30细胞中Akt的磷酸化并激活p53通路Fig.5 DTS inhibits the phosphorylation of Akt and activates p53 pathway in HN30 cells.A:Western blot analysis of the phosphorylation level of Akt and p53 after treatment with DTS(10 μmol/L)for 0.5,1,2,4,8,and 16 h.B-D:Quantification of the protein expressions.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 vs the 0 h group.

3 讨论

本研究发现活性含硫化合物DTS对头颈癌HN30细胞具有显著的增殖抑制和凋亡诱导作用。DTS刺激后，HN30细胞中cleaved caspase-3蛋白呈剂量依赖性增加，Bcl-2蛋白呈剂量依赖性降低；同时，随着DTS作用时间延长，Akt磷酸化受到抑制，p53的磷酸化水平增加。这些结果表明DTS在HN30细胞中具有显著的抗肿瘤活性。

DTS是从药用植物Petiveria alliacea L中分离出的一种多硫化物，早期被报道具有抗病毒、消炎镇痛、免疫调节等作用［14］，但是针对单体化合物DTS的抗肿瘤作用机制研究较少，本研究旨在探讨DTS单体化合物的抗肿瘤作用。已有文献报道，作为特异性RSK激酶抑制剂，WST-1初步检测发现DTS对肺癌、乳腺癌及胰腺癌细胞具有体外抗增殖作用［8］。与本研究结果相似，DTS在头颈癌中也被证实具有抗增殖活性，但本研究发现DTS 还具有显著的凋亡诱导作用，进一步确证了DTS对头颈癌的抗肿瘤作用。目前，针对DTS抗肿瘤作用的机制研究很少，深入探寻其作用靶点十分必要。有研究表明DTS能减弱神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中丝裂原活化蛋白激酶MAPK（Erk1/2）酪氨酸残基的去磷酸化，造成细胞微管解聚并抑制神经突触生长［15］。研究显示，DTS的类似物双（4-氟苄基）三硫化物通过共价结合β-微管蛋白Cys 12残基，直接抑制微管聚合，导致微管稳定性的破坏，从而阻滞细胞的G2/M期［16］。与已有研究不同，本研究通过时间依赖性实验证实DTS可能影响Akt和p53蛋白的磷酸化，在头颈癌HN30细胞中发挥作用，并且其凋亡诱导与线粒体膜电位降低相关，进一步丰富了DTS在抗肿瘤机制方面的研究结果。

Akt参与调节细胞存活、增殖、生长、凋亡、糖原代谢等多过程，具有广泛的生物学活性，研究发现Akt的磷酸化影响了多种肿瘤细胞的凋亡、迁移［17］。对大肠癌患者的结直肠组织的分析结果显示p-Akt表达的上调与肿瘤发生发展、侵袭转移密切相关［18］。在HER2阳性乳腺癌中，p-AKT的高基础水平表达与肿瘤进展和耐药性相关［19］。本研究中，DTS刺激不同时间收集HN30细胞蛋白，通过免疫印迹实验发现Akt总蛋白水平未见明显差异，但p-Akt表达量明显抑制，证实DTS对于HN30细胞的抗肿瘤活性与p-Akt的抑制相关。

肿瘤抑制蛋白p53调控细胞凋亡、周期及DNA损伤修复过程，在恶性肿瘤的发展和进程中起着至关重要的作用，因本身基因突变或激活机制缺陷，p53在多种肿瘤中处于功能丧失状态，因此靶向p53成为目前肿瘤治疗的热点［20-22］。本研究中，DTS作用后，p53总蛋白及p53磷酸化均显著增加，表明DTS通过促进p53的磷酸化，激活p53功能从而影响了HN30细胞的增殖和凋亡。

本研究发现DTS能够有效抑制头颈部鳞状癌细胞HN30的增殖，并激活凋亡相关信号通路以线粒体途径诱导细胞凋亡，其作用机制与Akt/p53信号通路相关。该发现揭示了DTS作为潜在抗肿瘤活性药物可能的作用机制和靶点，同时也为头颈癌的治疗提供了参考依据。