王向锋，黄小为，田朋鑫（.郯城县第一人民医院，山东 临沂 7600；.临沂市检验检测中心，山东 临沂 76000）

阿昔莫司（acipimox），化学名为5-甲基吡嗪-2-甲酸-4-氧化物，由美国辉瑞制药公司开发，于1985年首次在意大利上市[1]，1988年被我国列入国家基本药物品种目录。阿昔莫司是烟酸衍生物，可降低低密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油和载脂蛋白的水平，临床用于治疗高三酰甘油血症和高胆固醇血症[2-5]。阿昔莫司多采用5-甲基吡嗪-2-甲酸进行氧化制备[6-8]，在氧化反应的过程中，1位的氮同样会发生氧化反应，从而生成副产物5-甲基吡嗪-2-甲酸-1-氧化物（杂质Ⅰ）和5-甲基吡嗪-2-甲酸-1，4-二氧化物（杂质Ⅱ）。其反应路线如图1所示。阿昔莫司的质量标准收载于《中国药典》2020年版二部[9]，在其质量标准中仅将其起始原料5-甲基吡嗪-2-甲酸（杂质Ⅲ）作为已知杂质，采用外标法进行测定，并未对其副产物杂质进行控制。然而，两种副产物杂质在精制的过程中并不能完全除去，严重影响了阿昔莫司的纯度。本文首次建立HPLC方法对阿昔莫司原料药中3种杂质进行测定，为其质量控制提供依据。

图1 阿昔莫司的合成路线及杂质的结构式Fig 1 Synthetic route of acipimox and structure formula of impurities

1 仪器与试药

Agilent1260型高效液相色谱仪，含二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱和二元泵（美国Agilent公司）；Mettler XP205电子分析天平（瑞士Mettler公司）。

阿昔莫司对照品（纯度：99.9%，批号：100750-201702）、阿昔莫司杂质Ⅲ对照品（纯度：100%，批号：101360-201501）（中国食品药品检定研究院）；阿昔莫司杂质Ⅰ对照品（纯度：99.7%，批号：D1912011）、阿昔莫司杂质Ⅱ对照品（纯度：99.6%，批号：D1912021）（临沂莱博医药公司）；阿昔莫司原料药（批号：AX200501、AX200502、AX200503，临沂莱博医药公司）；甲醇为色谱纯；磷酸与四丁基氢氧化铵均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相：甲醇-0.01 mol·L－1四丁基氢氧化铵溶液（用磷酸调节pH 6.0）（7∶93）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：264 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品储备液 精密称取阿昔莫司对照品52.33 mg、杂质Ⅰ对照品51.20 mg、杂质Ⅱ对照品49.56 mg和杂质Ⅲ对照品38.66 mg，分别置50 mL量瓶中，用流动相溶解，并稀释至刻度，摇匀。

2.2.2 混合对照品溶液 精密量取各对照品储备液1 mL，置同一1000 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。

2.2.3 系统适用性试验溶液 精密称取阿昔莫司对照品约10 mg，置10 mL量瓶中，精密加入杂质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对照品储备液各10 μL，用流动相溶解并稀释至刻度，制成含阿昔莫司约1000 μg·mL－1，含杂质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ约1 μg·mL－1的溶液，作为系统适用性试验溶液。

2.2.4 供试品溶液 精密称取阿昔莫司约100 mg，置100 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.3 专属性试验

取“2.2”项下系统适用性试验溶液、混合对照品溶液、供试品溶液与空白溶液（流动相），分别进样测定，记录色谱图。各成分色谱峰的分离度均大于1.5，以阿昔莫司色谱峰计理论板数在5000以上。

图2 阿昔莫司HPLC色谱图Fig 2 HPLC chromatogram of acipimox

2.4 线性关系考察

取“2.2”项下对照品储备溶液10、50、100、500、1000 μL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释制成系列浓度混合对照品溶液，分别进样，以质量浓度C（μg·mL－1）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。

表1 3种成分回归方程、LOD及LOQTab 1 Regression equation，LODs，and LOQs of 3 compounds

2.5 定量限与检测限

取混合对照品溶液，用流动相逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件测定，分别以S/N＝10、S/N＝3求得杂质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的定量限（LOQ）和检测限（LOD），结果见表1。

2.6 精密度、稳定性和重复性

按“2.2.2”项下方法制备混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，结果杂质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰面积的RSD分别为0.76%、0.82%和0.93%，表明仪器精密度良好。

取同一供试品溶液（批号：AX200501），室温放置，于0、2、6、12和24 h分别进样测定，结果杂质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰面积的RSD分别为0.86%、1.1%和0.84%。表明溶液在室温条件下放置24 h内稳定。

取同批样品（批号：AX200501），共6份，分别按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果杂质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的含量的RSD分别为0.65%、0.52%和0.77%，表明重复性良好。

2.7 回收试验

精密称取已知杂质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ含量的样品（批号：AX200501）约50 mg，共9份，置100 mL量瓶中，分别精密加入杂质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ对照品储备液10、20和30 μL，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，计算各有关物质的回收率，结果见表2。

表2 回收试验Tab 2 Recovery

2.8 耐用性试验

对方法耐用性进行试验，分别考察了不同型号的色谱柱CAPCELL CORE C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）和Shim-pack Velox C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），通过改变色谱柱的柱温（20℃、40℃及室温）、流速（0.8 mL·min－1及1.2 mL·min－1）等试验条件，考察各色谱峰分离情况，结果阿昔莫司峰与相邻杂质峰以及各杂质峰之间均能达到基线分离。微调流动相中四丁基氢氧化铵溶液的浓度（0.009 mol·L－1和0.011 mol·L－1）和pH值（pH 5.9和pH 6.1）对耐用性进行考察，结果各色谱峰之间分离良好。表明本试验方法的耐用性良好。

2.9 样品杂质含量测定

取3批阿昔莫司原料药，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。采用外标法分别计算杂质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的含量，结果见表3。

表3 杂质含量测定结果(%，n＝2)Tab 3 Determination of impurity (%，n＝2)

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

参考2020年版《中国药典》二部阿昔莫司有关物质检查项色谱条件，选用甲醇-0.01 mol·L－1四丁基氢氧化铵溶液作为流动相，并对其比例进行优化。当流动相比例为15∶85（药典中流动相比例）时，杂质Ⅰ峰与阿昔莫司峰不能完全分离，降低流动相中甲醇的比例，各成分色谱峰的分离度均有较大改善，且均能达到基线分离。

本文采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱，该色谱柱为2.7 μm粒径填料的核壳型色谱柱，由于表面多孔型填料具有极窄的粒径分布和扩散路径，同时可以减小涡流扩散，缩短传质路径和减弱传质阻力，其柱效可获得2 μm粒径填料的色谱柱同等效果[10-11]。且此类型的色谱柱一般操作压力在20 MPa左右，故可以在耐压40 MPa的普通液相色谱系统上运行，使得在普通高效液相色谱仪实现超高效液相色谱的分析效率[12]。

3.2 有关物质分析

阿昔莫司的起始原料5-甲基吡嗪-2-甲酸中吡嗪环的1位和4位氮元素具有相似的活性，在氧化反应过程中，均有被氧化的概率，从而生成杂质Ⅰ和Ⅱ。此两种氧化物杂质与5-甲基吡嗪-2-甲酸在结构上与阿昔莫司相似，也具有相似的理化性质，在精制过程中不能完全去除。本文检测结果表明，3种有关物质均有不同程度的残留，严重影响了阿昔莫司的纯度，应当建立检测方法严格控制。

3.3 小结

本文建立HPLC方法对3种有关物质的含量进行测定，结果显示方法灵敏度高，重复性好，结果准确，可用于阿昔莫司原料药中3种杂质的测定，为阿昔莫司原料药中有关物质的检查提供了依据。

致谢：感谢临沂莱博医药公司为本研究无偿提供的杂质对照品和阿昔莫司原料药。