刘学武，陈琼芳，唐小燕，姜德建，张妙红（湖南普瑞玛药物研究中心有限公司 ＆ 湖南省药物安全评价研究中心 ＆ 新药药效与安全性评价湖南省重点实验室，长沙 410331）

吸入给药是通过直接作用于呼吸系统来发挥局部和全身治疗作用的一种特殊给药途径。对于局部性的适应证（如咽峡炎、气管-支气管炎、肺炎等），吸入给药能通过药物在呼吸系统局部的高暴露（直接作用于患病部位）和持续滞留而发挥其治疗作用和优势；对于全身性的适应证，吸入给药能绕过肝脏首过效应而增加其生物利用度。但吸入给药最大的安全性风险也来自于呼吸系统局部的药物高暴露和持续滞留，同时呼吸系统解剖结构复杂、吸入制剂给药较为复杂（属于药械组合）等特点则为吸入给药的安全性评价带来了一定挑战。

1 吸入给药安全性评价一般考虑

吸入制剂的安全性评价应根据其研发目的进行研究内容的选择，对于1类创新药，通常应进行两个种属的一般毒性试验（啮齿类一般为大鼠，非啮齿类一般为Beagle犬，生物制剂可选择非人灵长类）、安全性药理试验（中枢神经系统和心血管呼吸系统）、特殊安全性试验（呼吸道刺激性试验和主动全身过敏试验，其中刺激性试验可伴随在重复给药毒性试验中进行考察）、特殊毒性试验（遗传毒性、生殖毒性和致癌性）。对于改良型新药，应根据其原有剂型和途径的特点进行相应试验项目的选择，美国食品药品管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）对改剂型和改变给药途径药品的非临床安全性评价的原则主要通过暴露量的差异（新剂型/新给药途径vs旧剂型/旧给药途径）进行评估[1]，当现有毒性资料不足以支持新剂型/新给药途径的暴露量，或新剂型/新途径的体内暴露模式较原剂型或原途径有明显改变时，应针对新剂型/新给药途径开展对应的毒性试验研究。因此，针对改良型吸入制剂，不管适应证是局部或全身，可通过现有暴露途径的安全性数据的桥接，来评估新剂型/新给药途径的安全性风险（包括对暴露靶器官或暴露模式的评估等），并可通过新开展部分安全性试验（如一般毒性等）补充所缺乏的安全性信息，如甘露醇静脉改吸入的改剂型研究[2]增补了一般毒性伴随毒代动力学试验研究，其他安全性评价研究（生殖毒性、遗传毒性、致癌性等）均引用了甘露醇静脉给药途径的相关毒理学数据（高暴露途径评估低暴露途径）。另外，肺脏含有以巨噬细胞为主的免疫调节细胞，气溶胶吸入后可通过激活抗原，引发胃肠外的免疫反应[3]，其中以蛋白/多肽类吸入制剂较易诱发肺脏的过敏反应，故针对吸入给药途径的生物制品，应通过吸入给药的全身过敏试验，考察受试物导致的呼吸系统主动过敏反应风险。

2 吸入给药安全性评价的影响因素

2.1 受试物

受试物信息的全面性是安全性评价的前提，基本信息应包括处方组成、来源、批号、储存条件、有效期、溶解性和配制方法等[4]。对于不同类型的吸入制剂，其受试物信息侧重点应有不同，例如干粉吸入剂（dry power inhalation，DPI）通常采用微粉给药，其受试物信息的侧重点应包括以下几个方面：

① 处方组成：制剂处方通常由有效成分和辅料成分组成，DPI的辅料包括乳糖、硬脂酸镁、甘油、甘氨酸等。辅料的使用对吸入制剂的稳定性、颗粒形成、流动性及药物的沉积和吸收均有不同的促进作用，但同时也会带来安全性风险。FDA对吸入制剂中辅料的种类和用量均有明确规定[5]，如DPI中无水的乳糖限度不应超过2.5%。对于处方中含有特殊辅料的，应进行辅料的安全性评估，例如格隆溴铵吸入粉雾剂的辅料主要为乳糖一水合物、硬脂酸镁等，故其重复给药毒性试验设置辅料对照组（1%硬脂酸镁和99%乳糖一水合物）考察辅料的安全性[6]。

② 粒径分布：吸入制剂进行安全性评价时，需对气溶胶的质量中值粒径（median mass aerodynamic diameter，MMAD）和几何标准偏差（geometric standard deviation，GSD）进行监测，其中经济合作与发展组织（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD）吸入毒性试验指导原则对气溶胶的MMAD要求为1～4 μm（建议为1～2 μm），其目的是充分暴露受试物对呼吸道下段（支气管和肺脏）的安全性风险。吸入气雾剂和吸入溶液所形成气溶胶的粒径分布主要与其配套的器械直接相关。DPI的粒径分布则属于其本身的物理属性，但其粒径分布的稳定性与储存条件和给药时的湿度直接相关[7]，湿度过高可能引起微粉聚集和成团等问题，从而改变吸入微粉本身的粒径分布和颗粒属性，熊莲洁等[8]对鲑降钙素吸入粉雾剂的粒径分布研究发现，相对湿度为23%和52%时，微粉成圆整的分散状态；但当相对湿度达75%时，发生较多的粘连和聚集，粒径分布有较大改变。因此DPI进行雾化给药时，常会因其吸入微粉的高吸湿性导致其实际粒径分布有较大偏离[9]。故在进行DPI非临床研究时，应严格控制湿度，以真实地反应受试物的安全性问题。

2.2 给药方式

2.2.1 给药途径 吸入制剂的给药途径包括经口鼻吸入给药（吸入溶液）和经口腔吸入给药（气雾剂和粉雾剂），非临床研究的给药途径原则上需与临床拟用途径一致，但同时需兼顾动物的依从性和可操作性等因素。吸入制剂在非临床研究阶段，以经口鼻吸入给药与临床拟用途径最为接近，通常采用吸入染毒舱进行口鼻吸入给药，以最大限度地模拟吸入制剂的给药方式。

2.2.2 给药频次及时长 吸入制剂的给药时长不宜过长，OECD指导原则对急性毒性试验的推荐最长给药时长为6 h[10]。重复给药毒性试验的时长以满足暴露量为目的，在暴露量足够的情况下，15～30 min较为合适。当气溶胶浓度较小时，只能通过延长给药时长来增加暴露量，但最长不宜超过1 h，给药频次一般为1次·d－1。吸入给药时，长时间和反复多次的保定会影响动物的状态[11-12]，导致各项生理参数偏离实验室的背景数据，影响药物的毒性评价。如格隆溴铵吸入粉雾剂的药理毒理申报资料显示，每日采用面罩经口鼻吸入60 min未引起Beagle犬的体重增长和其他生理参数的异常，但每日连续120 min经口鼻吸入给药后发现，与空气对照组比较，辅料对照组大鼠体重增长速度显著降低[6]。福莫特罗粉雾剂的Beagle犬一般毒性试验则采用不同暴露时长进行剂量区分，其中低、中、高剂量的暴露时长分别为15 min/次、30 min/次、60 min/次[13]。

2.3 给药剂量

2.3.1 剂量间距的设置 吸入制剂的非临床评价通常需设置至少3个给药剂量，以反映受试物的量效关系。吸入制剂给药剂量与诸多因素相关，包括气溶胶浓度、吸入时间和吸入对象的呼吸状态（如呼吸频率、潮气量等），故剂量间距可适当扩大，以避免出现暴露量与给药剂量倒置的现象，通常至少应达到3倍的剂量间距，如阿福莫特罗吸入气雾剂以3 mg·kg－1为起始剂量，以3倍剂量间距设置中、高剂量，对大鼠进行连续3个月重复给药的毒性试验[14]；格隆溴铵吸入粉雾剂以0.5 mg·kg－1为起始剂量，以9、10倍剂量间距设置中、高剂量，对大鼠进行连续3个月的重复给药毒性试验[6]；阿地溴铵吸入粉雾剂则以0.006 mg·kg－1作为低剂量，以3.6、7.3倍剂量间距设置中、高剂量，对Beagle犬进行6个月的重复给药毒性试验[15]。

2.3.2 气溶胶浓度对给药剂量的影响 气溶胶浓度与受试物的理化性质（浓度、黏度等）、雾化气流量（包括气流速度和压力，主要针对雾化用吸入溶液）等相关。吸入给药时气溶胶浓度的表示方式众多，包括了名义浓度、理论浓度、实际浓度，OECD对液体和固体型气溶胶浓度的允许偏差为±20%[10]。在进行吸入制剂的非临床研究时，实际浓度（以有效成分计算）是主要的气溶胶浓度表示方式，可通过不同的手段进行检测，对于液体制剂（气雾剂和吸入溶液，通常为混合物，常含有溶剂、pH调节剂、促渗剂等），通常可采用高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）等分析手段进行检测，以反映有效成分的含量。对于无挥发性的单一化合物（如粉雾剂），可考虑直接采用称重法进行气溶胶浓度的检测。

2.3.3 通气量和气流量对给药剂量的影响 吸入给药剂量根据固定的换算公式进行计算，常用的计算公式为D＝（C×RMV×T）/BW，其中D为给药剂量，C为暴露口处的气溶胶浓度，RMV为动物的每分钟通气量，T为吸入给药时长。RMV通常以健康动物的平均每分钟通气量进行代入计算，因此吸入给药剂量属于较为粗略的计算公式，动物的每分钟通气量和动物健康状态直接相关，对于有呼吸道毒性的药物，可适当考虑实际通气量与理论通气量的差异对吸入给药剂量的影响。

雾化气流量除了可用于形成气溶胶外，还可用来提供动物在吸入给药时的氧气，故气流量不应低于所有动物的每分钟通气量之和，通常至少设置为其的2倍以上，在此基础上，可通过调整雾化气流量的大小来获得不同浓度的气溶胶。但气流量也不宜过大，任俊明等[16]研究发现，持续2 h对大鼠进行2倍潮气量的机械通气，可导致大鼠形成明显的肺脏损伤。不同剂量组间，等给药时长（剂量组间浓度不相同）、不等给药时长（剂量组间浓度相同）是较常见的给药方式，两种给药方式均有各自的优缺点。其中等给药时长可以排除不同保定时长对动物的影响，但因不同浓度气溶胶之间的粒径差异，可能导致结果出现一定偏差。不等给药时长（剂量组间浓度相同）克服了气溶胶浓度对粒径的影响，但在需长时间保定来进行吸入给药的研究中，易出现因动物保定时间过长所导致的假阳性结果（如体重降低、活动减少等）。

2.3.4 气溶胶粒径对给药剂量的影响 粒径分布影响着吸入制剂气溶胶在呼吸道不同部位的沉积量。Winkler等[17]采用小鼠气道模型模拟颗粒物在人呼吸道的沉积作用，发现小于3 μm的颗粒主要沉积在肺部，肺脏沉积量随着颗粒物直径增大而减少，而对于粒径大于3 μm的颗粒，气道滤过作用将颗粒物大部分截留在上呼吸道。Kuehl等[18]则分别通过SPECT/CT对99mTc标记的0.5、1.0、3.0、5.0 μm的气溶胶颗粒进行示踪，以考察不同粒径大小的气溶胶颗粒在肺内的分布差异。结果显示，小鼠与大鼠体内的沉积比例随着气溶胶粒径的减小而升高，其中肺内沉积量主要以1.0～5.0 μm的气溶胶为主。通常5～10 μm的气溶胶主要沉积于咽、喉部；3～5 μm的气溶胶主要沉积于肺部；小于3 μm的气溶胶则有50%～60%沉积于肺泡，能实现被动的肺泡靶向目的[19]；另外，小于2.5 μm的气溶胶则因过多的肺部沉积，而难以发挥针对支气管的药效作用，同时导致系统毒性风险增加[19]。气溶胶的粒径分布反映的是不同粒径大小的气溶胶所占的百分比，在进行药物安全性评价时，可将给药剂量换算为呼吸道沉积剂量，考察实际作用剂量[20]，以更精确地反映呼吸道不同水平的毒性反应与给药剂量的关系。如福莫特罗粉雾剂的一般毒性研究中，除了表征受试物的吸入剂量以外，还根据气溶胶的粒径分布特性考察了气道的实际沉积量，最终得到大鼠连续6个月吸入给药的实际最大无毒性剂量（no observed adverse effect level，NOAEL）约为6.3 mg·kg－1，仅为吸入给药剂量的0.17倍[15]。

2.4 吸入给药的质量控制

吸入给药时的质量控制是保证动物给药量准确的重要手段，它是通过一系列的验证性试验来证明吸入制剂经雾化后形成的气溶胶浓度是稳定和均一的，其目的是确保吸入给药的批内和批间（同组内不同动物之间以及相同动物不同给药时间点之间）剂量的一致性。目前国内外对此项研究的报道较少，虽然OECD对其合格标准进行了约定，即不同暴露通道之间的气溶胶浓度差异应在平均气溶胶浓度的±20%范围内（针对液体和固体型气溶胶），但各国的监管部门并未出台相应的指导原则来对质量控制的验证方法进行约定。目前各个研究单位对质量控制的验证方法的内容大致相似，主要包括气溶胶采样方式验证、雾化气溶胶的浓度均一性和稳定性验证、气溶胶的粒径均一性和稳定性验证、其他相关验证。

2.4.1 气溶胶采样方式验证 气溶胶的采样方式包括多种，如滤膜采样、采样瓶采样、吸收袋采样等[21]。其中滤膜采样的验证内容主要包括滤膜材质的选择和滤膜回收率的考察。滤膜的材质需根据受试物气溶胶理化性质进行选择，常用的滤膜有玻璃纤维、石英纤维、聚四氟乙烯等[22-23]（见表1），其中以石英纤维和玻璃纤维滤膜使用频率较多，孔径多为0.22 μm，各种滤膜的使用范围及优缺点性能详见表1；同时应对滤膜上受试物的回收率进行考察，回收率的标准目前尚无指导原则和规范性文件进行约束，多数文献报道均在90%以上，以确保滤膜的批件差异不影响气溶胶浓度的检测。徐思琦等[24]对醋酸纤维滤膜和玻璃纤维滤膜进行了加标回收试验考察，结果显示，气溶胶中碘、溴的回收率均在92%～101%。

表1 不同采样滤膜的性能及优缺点Tab 1 Performance，advantages and disadvantages of different sampling filter membranes

采样瓶采样的验证内容包括吸收液的种类和体积验证。吸收液种类需根据受试物的理化性质进行选择，蛋白多肽类气溶胶可选择生理盐水作为吸收液；小分子化合物则可根据受试物的分析方法选择相应的有机溶剂（流动相）作为吸收液。吸收液的体积可根据采样流量和采样浓度进行调整，气溶胶流经吸收液后，其总吸收效率应不低于95%，其验证方法可通过串联多级采样瓶来实现。

2.4.2 雾化气溶胶的浓度稳定性和均一性验证临床上吸入给药常规的给药时长为15～30 min，但在非临床研究阶段，往往需通过延长吸入时长来达到增大暴露量的目的，因此雾化器产生稳定浓度的气溶胶的能力直接影响到了动物在吸入给药时的给药剂量稳定性。通常采用一段时间内的雾化稳定性考察，以支持正式试验中相应时长的连续给药。同时可通过重复至少3个批次的稳定性验证，以考察雾化器重复多次雾化的批间差异。颗粒物的沉降导致不同位置气溶胶浓度的差异[25-29]，雾化均一性验证是考察不同位置（暴露口，尤其是上、中、下层）的气溶胶浓度差异，用于支持多只动物的批量性吸入给药。

2.4.3 粒径稳定性和均一性验证 影响气溶胶粒径分布的因素包括化学成分（尤其是液体吸入制剂，如溶剂、活性成分等，会因黏度、吸附和聚集性等影响粒径）[30]、雾化气流量（或压力）[31-32]、温湿度、颗粒运动（如沉降）等，对不同浓度的气溶胶进行粒径的稳定性和均一性验证可减少粒径分布的波动。目前暂无相关指导原则或法规性文件约定粒径分布的验证频率及方法，伴随在气溶胶浓度的稳定性和均一性验证过程中开展一定程度的粒径分布考察，对雾化器的选择、药效结果以及安全性风险的预测具有一定作用。

2.4.4 其他验证 其他验证还包括吸入仪器的清洗验证等，通过对吸入暴露系统各仪器部件的清洗方法进行考察，以确保清洗彻底，并能减少不同剂量组间交叉污染的可能性。

2.5 检测指标

2.5.1 肺功能检查 肺功能检查提供了一系列能反映受试物对呼吸系统生理状态影响的客观指标，包括呼吸功能和非呼吸功能检测，其中呼吸功能可包括通气功能、换气功能、小气道功能、气道阻力和肺顺应性、呼吸动力学以及气道反应性等[33-39]，非呼吸功能参数主要针对呼吸系统的生物活性物质的代谢，包括肺泡灌洗液和肺脏中的细胞因子、总蛋白和乳酸脱氢酶含量、白细胞计数和分类以及免疫细胞分型等[40-43]。

2.5.2 常规病理染色 吸入制剂的安全性评价较常规给药途径有诸多特殊考虑点，与常规给药途径的一般毒理学试验比较，呼吸系统的安全性是重点考察对象，通常需对呼吸系统进行多个组织水平的考察[44-45]，以评价不同粒径分布的气溶胶对呼吸系统的影响（见表2）。吸入给药的检查器官较常规给药途径增加了嗅球、舌、鼻咽部、喉部、胸膜、肺门淋巴结和眼睑的检查，同时在鼻咽部需进行四水平的检查，确保能观察到鳞状上皮、移行上皮、呼吸上皮和嗅上皮以及鼻淋巴结；喉部则需进行三水平的检查；肺脏和肺门淋巴结通常合并在一起进行检查，并需进行三水平的考察。另外眼睑等与受试物有频繁接触的部位也应进行重点考察。格隆溴铵粉雾剂[6]和阿福莫特罗吸入气雾剂[46]均通过对呼吸系统进行多组织器官和多水平的考察，来评估其呼吸系统的安全性风险。其中格隆溴铵能引起鼻腔和鼻窦嗜酸性细胞的聚集、上皮细胞脱落、杯状细胞肥大；喉上皮生化和鳞状上皮生化；支气管肺泡连接处细胞肥大等。阿福莫特罗吸入气雾剂则主要引起肺脏的炎症细胞聚集。

表2 吸入给药和非吸入给药的一般毒性试验中呼吸系统组织病理学检查要求的比较Tab 2 Histopathological examination requirements of the respiratory system for inhaled and non-inhaled drugs in general toxicity test

2.5.3 特殊病理染色 特殊染色能反映肺脏的特异性病理改变，如肺内异物沉积（如难溶性药物、粉尘等），导致巨噬细胞吞噬和裂解，释放磷脂等肺泡表面活性物质以及肺泡液体内的其他蛋白结合物，则会表现为PAS染色阳性[47]；Masson染色则能反映肺脏的胶原沉积和纤维化病变程度[48]。

2.6 恢复期的设置

吸入给药的恢复期设置应结合药物对呼吸系统的毒性作用的可逆性以及药物在肺部的清除动力学进行设置，通常易溶性药物具有较快的清除过程，其清除方式主要为溶解和扩散[19]；难溶性药物的清除过程较慢，易在肺部沉积，其清除过程以巨噬细胞的吞噬和纤毛外排[49-51]，且吞噬速度具有显著的粒径依赖性，粒径越小，吞噬速度越慢，故通常需设置至少2个停药恢复期，以考察受试物在肺内的清除动力学[52]。谢赫然[53]考察炭黑在肺部的吸收、沉积和消除过程的结果显示，连续28 d吸入炭黑染毒，可见大量炭黑沉积于肺间质，少量沉积于肺泡间，停止染毒14 d后，肺内炭黑清理率仅为27.5%，且恢复期和给药期的肺脏病理变化类型相同，程度相似，提示14 d的恢复期不足以反映肺脏清除的可逆性。

3 吸入给药安全性评价的结果分析

吸入给药的安全性评估需对受试物毒性作用的临床意义进行甄别，例如格隆溴铵粉雾剂[6]的一般毒性研究中可见鼻腔和鼻窦嗜酸性细胞的聚集、上皮细胞脱落、杯状细胞肥大，但因粉雾剂在临床应用是主要通过口腔吸入给药，鼻腔（包括鼻甲等部位）与药物基本无接触，故在非临床研究阶段的毒性发现虽有生物学意义，但其临床意义不大。另外，大鼠与人在鼻腔、咽喉部解剖结构的差异同样会对受试物毒性反应的临床意义评估造成影响，需仔细辨别。

4 总结与展望

吸入制剂是一类药械组合的特殊制剂，属于近年来发展较快的新兴剂型之一，在非临床研究阶段除了自身的器械（如雾化机、喷雾瓶等）外，还需引入额外的给药系统（大、小动物吸入染毒系统），以达到动物吸入给药的目的。吸入制剂非临床研究内容的选择应考虑研发目的、气溶胶的粒径分布和其他理化性质，同时试验设计需综合考虑给药时长、给药浓度对暴露剂量的影响。吸入给药剂量的确定是吸入制剂进行非临床评价的难点之一，气溶胶的粒径分布特性决定其在呼吸道的沉积位置以及沉积剂量，多种数学模型[如多路径粒子剂量测定模型（multiple path particle dosimetry models，MPPD）、生理基础药代动力学 模 型（physiologically based pharmacokinetic，PBPK）等[54]]均可作为气溶胶的特性与肺沉积量的关系研究提供了多样性的工具和手段。如何将吸入给药剂量与临床给药量进行桥接是将吸入制剂进行临床转换需解决的重要问题之一。我国针对吸入给药的非临床研究指导原则几乎没有，且针对吸入给药安全性评价过程中的关键点和评价标准尚未形成统一的共识，尤其是针对吸入给药过程中的质量控制方法及合格标准尚无相应的指导性文件作为支持，这也为吸入给药的安全性评价带来了一定的挑战，同时也制约了国内吸入制剂非临床评价工作的开展和吸入制剂的新药研发。本文根据文献资料、吸入制剂申报资料和自身研究经验进行了一些关键点的总结，以期为吸入制剂非临床评价的规范化和标准化提供参考。