刘菊，白明学*，张红伟，金云隆，吕鹏，高晓洁（.郑州市中医院，郑州 450007；.河南省食品药品检验所，国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，郑州 45008）

升降茶由大黄、姜黄、僵蚕、蝉蜕4味中药组成，具升清降浊、散风清热之功，主治温病表里三焦大热，症见低热或未发热、干咳、少痰、咽干咽痛、倦怠乏力、胸闷、脘痞、呕恶、便溏等。该品种是2020年3月郑州市中医院在河南省食品药品监督管理局应急备案的中药制剂，该方来源于经典名方升降散。

中药复方制剂成分复杂，其疗效经多成分、多靶点协同作用。指纹图谱技术对中药制剂质量控制具有针对性和合理性[1]。单一成分的含量测定也无法全面、真实地评价其整体质量。王智民等[2-3]率先提出一测多评法（QAMS），即利用一种成分的对照品作为内参物，建立该成分与其他成分之间的相对校正因子，通过相对校正因子计算其他成分含量，来实现多个成分的同步测定，具有快速、简便、成本低等优点，近年来在中药复方制剂质量评价中广泛使用。为全面控制升降茶质量，本研究建立HPLC指纹图谱，从中药物质基础角度出发，系统、整体、稳定地表征其共有成分及内在特征。并采用一测多评法，以稳定易得、价格低廉的姜黄素为内标物，实现其他4种成分含量的同步测定。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；JA2003N电子天平（上海菁海仪器设备有限公司）；AB265-5型电子天平（d＝0.01 mg，梅特勒-托利多仪器有限公司）；超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；DZKW-4恒温水浴锅（河南天帝电子科技有限公司）。

1.2 试药

升降茶（郑州市中医院，批号：200125、200126、200127、200203、200204、200205、200206、202007、200208、200209，编号分别为S1～S10）。姜黄素（批号：110823-201706，含量：98.7%）、芦荟大黄素（批号：110795-201007，含量：98.0%）、大黄酸（批号：110757-201607，含量：99.3%）、大黄素（批号：110756-201913，含量：96.0%）、大黄酚（批号：110796-201922，含量：99.4%）对照品（中国食品药品检定研究院）。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC指纹图谱的建立[4-9]

2.1.1 色谱条件 色谱柱Phenomenex Lune C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，60%～70%B；5～12 min，70%～79.5%B；12～20 min，79.5%B；20～25 min，60%B），流速为1.0 mL·min－1，检测波长为254 nm，柱温为25℃。

2.1.2 对照品母液制备 分别取芦荟大黄素、姜黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解稀释制成每l mL含31.2 μg芦荟大黄素、423.9 μg姜黄素、31.8 μg大黄酸、49.5 μg大黄素、39.6 μg大黄酚的混合对照品母液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取升降茶内容物0.25 g，精密称定，加甲醇25 mL，超声处理30 min，放冷，补足重量，过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 单味饮片溶液制备 分别单独取大黄、姜黄、蝉蜕、僵蚕饮片0.1 g，按“2.1.3”项下方法分别制成大黄、姜黄、蝉蜕、僵蚕单味饮片溶液。

2.1.5 精密度试验 取样品（批号：200125），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定6次，以6号峰（姜黄素）为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD均小于0.65%（n＝6），相对峰面积RSD均小于0.95%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取样品（批号：200125），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h进样测定，以6号峰（姜黄素）为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD均小于0.89%（n＝6），相对峰面积RSD均小于0.68%（n＝6），表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取样品（批号：200125），按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定，以6号峰（姜黄素）为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD均小于0.95%（n＝6），相对峰面积RSD均小于1.1%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.1.8 相似度评价 取10批升降茶，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A版）进行分析，10批次指纹图谱共有模式及生成对照图谱见图1。共标定出12个共有峰，由于6号峰（姜黄素）保留时间稳定、峰面积较大，对称度好，故选择其作为参照峰（S）。测得10批样品相似度分别为0.997、0.984、0.992、0.993、0.997、0.998、0.996、0.981、0.989、0.997，均大于0.98，表明各批次样品之间的质量相对稳定。

图1 10批样品HPLC指纹图谱共有模式及各成分对照图谱Fig 1 HPLC fingerprints common model of 10 sample batches and reference chromatograms of various constituents

图2 单味药HPLC指纹图谱Fig 2 HPLC fingerprint of single herb

2.1.9 共有峰指认归属 通过各峰保留时间并结合对照品溶液定位，确认出其中5个色谱峰，分别为5号峰芦荟大黄素、6号峰姜黄素、7号峰大黄酸、9号峰大黄素、11号峰大黄酚。通过单味姜黄、大黄、僵蚕、蝉蜕图谱比对，确认1～5、7、9、11号峰来源于大黄，6、8、10、12号峰来源于姜黄。

2.1.10 聚类分析 以10批升降茶作为研究对象，应用SPSS 22.0软件，以6号（姜黄素）峰为参照峰，将12个特征峰相对峰面积之和导入软件，采用中位数聚类法，欧式距离平方为测量区间，树状结果见图3，显示10批升降茶聚为3类，S1、S2、S3、S8、S9、S10聚为一类，S5、S6聚为一类，S4、S7为一类。这说明升降茶不同批次之间相对峰面积之和有所差异，这可能与饮片来源厂家、产地、批号差异有关，这为本品质量标准限度制订提供数据依据，也提示日后生产过程中，注意原料质量的稳定性和均一性。

图3 升降茶指纹图谱聚类分析树状图Fig 3 Cluster analysis diagram of fingerprint for Shengjiang tea

2.2 一测多评法测定5种成分含量[10-14]

2.2.1 对照品溶液制备 取“2.1.2”项下对照品母液5 mL，加甲醇稀释至10 mL，得混合对照品溶液。

2.2.2 阴性样品溶液制备 分别取缺大黄阴性制剂、缺姜黄阴性制剂，按照“2.1.3”项下方法进行处理，制成缺大黄、缺姜黄的阴性样品溶液。

2.2.3 专属性 分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，“2.1.3”项下供试品溶液，“2.2.2”项下缺大黄阴性样品溶液、缺姜黄阴性样品溶液各10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，理论板数按姜黄素峰计不低于3000，分离度大于1.5，阴性样品无干扰，见图4。

图4 升降茶各成分HPLC色谱图Fig 4 HPLC chromatogram of various constituents in Shengjiang tea

2.2.4 线性关系考察 取“2.1.2”项下混合对照品母液，逐级稀释后分别进样测定，记录峰面积。以质量浓度（μg·mL－1）为横坐标（X），峰面积（mAU*s）为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得5种成分的回归方程、相关系数、线性范围见表1，5种成分在各自范围内与峰面积线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab 1 Linearity of various constituents

2.2.5 相对校正因子测定 将“2.2.4”项下不同浓度混合对照品溶液分别进样10 μL，以姜黄素为内标，计算其他4种成分的相对校正因子，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab 2 Relative correction factor of various constituents

2.2.6 精密度验证 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，进样测定6次，测得芦荟大黄素、姜黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚面积RSD分别为0.12%、0.23%、0.54%、0.18%、0.27%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性验证 取样品（批号：200125），按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样测定，芦荟大黄素、姜黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚含量RSD分别为0.54%、0.95%、1.1%、0.74%、0.89%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.2.8 稳定性验证 取样品（批号：200125），于0、2、4、8、12 h进样测定，测得芦荟大黄素、姜黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚峰面积RSD分别为0.23%、0.31%、0.44%、0.37%、0.35%（n＝5），表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.9 加样回收率验证 取已知含量样品（批号：200125）0.125 g平行6份，分别加入混合对照品溶液5 μL，按“2.1.3”项下方法进行制备，进样测定，芦荟大黄素、姜黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚加样回收率分别为100.2%（RSD＝1.1%）、99.8%（RSD＝0.30%）、99.6%（RSD＝0.53%）、99.9%（RSD＝0.85%）、100.3%（RSD＝1.2%）。

2.2.10 相对校正因子耐用性考察 更换Agilent1260色谱仪、岛津LC-2010 型色谱仪，更换 Agilent Extend-C18、Waters Symmetry C18、Phenomenex Lune C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），调节柱温25、30、35℃，调节流速0.8、1.0、1.2 mL·min－1，分别测定相对校正因子，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚相对校正因子分别在0.1856～0.1925、0.1465～0.1532、0.2998～0.3141、0.2446～0.2546内，RSD均小于2.0%，表明仪器、色谱柱、柱温、流速更改对相对校正因子无明显影响。

2.2.11 色谱峰定位考察 以相对保留时间为指标定位色谱峰，更换仪器、色谱柱考察对其的影响，结果见表3，可知仪器、色谱柱更改对相对保留时间均无明显影响。

表3 不同仪器、色谱柱对相对保留时间的影响(n＝6)Tab 3 Effect of different instruments and columns on relative retention time (n＝6)

2.2.12 样品含量测定 取3批样品，按 “2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算含量，结果见表4，两种方法所得结果无明显差异（RSD＜2%）。

表4 各成分含量测定结果(mg·g－1，n＝3)Tab 4 Content determination of various constituents (mg·g－1，n＝3)

3 讨论

3.1 质控指标选择

君药指针对主病或主证起主要作用的药物，其药力居方中之首，用量较作为臣、佐药大。所以现在部分学者认为升降散君药为大黄。大黄泻下、抗菌有效成分主要为蒽醌类化合物（大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚）。姜黄含姜黄素、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素等成分。目前关于大黄、姜黄化学成分定性定量研究较为成熟。但僵蚕、蝉蜕化学成分研究多集中在氨基酸、蛋白质、微量元素类成分，《中国药典》至今未收载其定性定量方法，也是目前含僵蚕、蝉蜕等动物药的中药制剂质量控制研究难点。因此本研究中升降茶含量测定仅选择芦荟大黄素、姜黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚作为质控指标开展研究。

3.2 色谱条件优化

本研究考察了乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液四种流动相系统，最终确定采用甲醇-0.1%磷酸溶液。对其梯度洗脱程序反复调试，确定了本文的洗脱条件。此条件下，各化学成分洗脱完全，色谱峰分离度及峰形较好，能够满足指纹图谱建立要求。

4 结论

本研究首次建立升降茶HPLC指纹图谱，并采用一测多评法同步测定芦荟大黄素、姜黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚的含量，10批制剂相似度均大于0.98，相对校正因子在不同仪器、色谱柱、流速、柱温条件下均较稳定，且操作简单，经济成本低，可用于升降茶的质量控制与评价。