许志，许必祥*，姜德建，贺静，刘雪辉，黄昆（.湖南天劲制药有限责任公司，长沙 4005；.湖南省药物安全评价研究中心，长沙 4033）

强骨生血口服液（简称QGSX）主要由骨液、党参、黄芪、灵芝、大枣、黑木耳组成，临床上常用于气血不足、肝肾亏虚、面色萎黄、筋骨萎软、缺铁性贫血、小儿佝偻病、妇女妊娠缺钙的治疗[1-4]。目前，在全世界人口中14 岁以下的儿童约占20%～25%，同时儿童患者数量占总患病人数的比例已超过20%[5-6]。儿童具有特殊的生理特点，处在生长发育的阶段，生理机能变化大，机体各个器官系统功能尚未成熟，同一药物在儿科人群体内的吸收、分布、代谢及排泄过程与成人不同，因此要对儿童用药进行适当的安全性研究[7]。本实验采用QGSX连续给药14周，通过临床表现、体质量、摄食量、血液理化指标、骨密度、激素检查、脏器系数、组织病理学检查，系统考察QGSX对幼龄大鼠的毒性反应情况，对其进行儿童用药临床前安全性评价研究，为其临床应用提供参考。

1 材料

1.1 动物

成年SPF级SD大鼠雌性（母鼠）20只；仔鼠160只（雌雄各半），鼠龄为分娩后第1日（PND1）[湖南斯莱克景达实验动物有限公司；实验动物使用许可证号：SYXK（湘）2015-0016]；饲养环境：在光/暗周期为12 h/12 h（光照时间7：00～19：00）、20～26℃，湿度50%～60%的条件下，饲养于SPF级湖南省实验动物中心，大鼠自购入起适应性饲养5 d，自由获取食物和饮用水。

1.2 试药与仪器

QGSX（规格：30 mL/瓶，相当于16 g生药/瓶，湖南天劲制药有限责任公司，批号：1805035）、甲紫溶液（1%结晶紫溶液）（广东恒健制药有限公司，批号：180201）、乌来糖（国药集团化学试剂有限公 司，批 号：20170301、20170413）、BC-5000Vet型兽用五类血液细胞分析仪（深圳迈瑞公司）、B203LED型生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）、LABOSPECT003型自动生化仪（日本日立仪器有限公司）、CA-530型自动血凝分析仪（日本希森美康雨有限公司）、Spectra Max i3x型多功能酶标仪（上海美谷分子有限公司）、PL203型电子天平[梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司]、BX43型生物显微镜＋MD50型数码成像系统（日本奥林巴斯公司）、小动物骨密度和身体成分分析系统（韩国InAlyzer）。血清试剂盒（日本和光纯药工业株式会社）。

2 方法

2.1 实验分组

根据《药物重复给药毒性试验技术指导原则》（2014）[3]，儿科用药非临床安全性研究技术指导原则（征求稿意见，2017年），采用裂窝设计法，断乳前，于首次给药前2日（PND6），随机将20只母鼠及160只仔鼠分为4个临时小组，每组5只母鼠及40只仔鼠。将母鼠放入新的大鼠笼具中；小组内部每窝动物抽取窝内编号为F01的雌性仔鼠和窝内编号为M01雄性仔鼠（共8只），交由组内母鼠编号为1的母鼠进行抚养；再自每窝其余动物中抽取窝内编号为F02的雌性仔鼠和窝内编号为M02雄性仔鼠（共8只），交由组内母鼠编号为2的母鼠进行抚养；依此类推直至将每窝中的仔鼠均匀分布至小组中各只母鼠抚养，并给予相应编号如，1-1-1～1-1-8，1-2-1～1-2-8……，其他笼依此类推。在断乳分笼当日，按照之前各组中不同性别动物编号的顺序进行重新编号，对应方法为将各笼动物的笼内编号为1的动物按笼号顺延并编为新的动物号，例如：1-1-1为1F01，1-2-1为1F02，1-3-1为1F03，1-4-1为1F04，1-5-1为1F05，1-1-2为1F06……1-5-4为1F30；依此类推进行其他动物的编号。

2.2 实验剂量及给药方式

实验组分为空白对照组和QGSX低、中、高剂量组（6.0、12.0、24.0 g生药·kg－1），儿童临床最高拟用剂量约为0.53 g生药·kg－1（按照1岁儿童体质量10 kg，每日用药5.3 g生药计），各组剂量分别为临床剂量按公斤折算的11倍、23倍、45倍。灌胃给药，首次给药为大鼠出生后第8日（PND8），每日给药1次，连续给药14周，同时设空白对照组（纯水），给药体积均为15 mL·kg－1[8]。

2.3 临床表现

对实验期动物进行一般笼旁症候观察，并及时记录，观察频率为每日一次。观察指标包括：动物外观、行为活动、呼吸、分泌物、排泄物、饮食情况、死亡情况（死亡时间、濒死前反应）等。如出现临床症状，需增加观察次数，以便详细观察动物中毒反应的症状及其起始时间、严重程度、持续时间、是否可逆。如发现动物死亡或濒死应及时对动物进行解剖观察并进行详细病理学检查。

2.4 体质量及摄食量测定

对动物体质量进行称量，哺乳期内仔鼠每日称重一次，哺乳期内母鼠及断乳后仔鼠每周称量二次，如果实验期间动物体质量变化明显，可增加称量次数。对动物摄食量进行测定，每笼每日添加一定量的饲料并做好相应记录，每周称量记录一次剩余饲料量，每周计算一次摄食量。摄食量计算公式如下：

摄食量（g·d－1×只）＝[加料总量（g）－剩余量（g）]/[存活动物数×测量间隔的天数＋死亡动物数×死亡动物存活天数]

2.5 血液理化指标

给药第14周后，对幼龄大鼠进行采血，用血液细胞分析仪测定白细胞计数及分类、红细胞计数、血小板计数、血红蛋白含量等检测；分离的血清分别用试剂盒测定天门冬氨酸氨基转移酶（AST），丙氨酸氨基转移酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、总胆固醇（CHOL）、葡萄糖（GLU）及三酰甘油（TG）等血液生化指标。

2.6 骨密度检测

给药第14周后，取幼龄大鼠胫骨，采用小动物骨密度和身体成分分析系统进行胫骨骨密度检测，测定幼龄大鼠的骨密度（BMD）值。

2.7 脏器系数

给药第14周后对摘除眼球取血后的大鼠进行剖检，称量脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、胸腺、睾丸/卵巢、附睾/子宫的质量，计算各脏器指数。称量前用滤纸吸干表面水分。脏器指数＝脏器湿质量（g）/体质量（g）×100。

2.8 激素检查

给药第14周后对大鼠血清中生长激素（GH）、甲状腺激素T3（T3）、甲状腺激素T4（T4）、促皮质激素（ACTH）、雌激素（E）、孕激素（PROG）、雄激素（androgen）进行检测。

2.9 组织病理学检查

给药第14周后，将对照组、高剂量组及尸检异常动物进行详细检查，如高剂量组动物某一组织发生与毒性相关的病理改变，需要对其他剂量组动物的相同组织进行组织病理学检查，受检的脏器为：大脑、小脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、胸腺、睾丸、卵巢。

2.10 数据处理

计量资料采用均数±标准差（x± s）表示，系统解剖及组织病理学采用定性指标判断结果。统计所用软件为SPSS 16.0，两两比较，采用Independent-Samples T检验；多组间比较先进行方差齐和正态性比较，方差齐且符合正态性时采用LSD-t或Dunnett-t检验，不符合正态性时采用Nonparametric T检验，符合正态性但方差不齐时采用Dunnett’s T3或Tamhane’s T2检验；计数资料用频数表示，采用χ2检验。统计结果以α＝0.05为检验界限，其中P≤0.05表示差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 临床表现

与空白对照组比较，大鼠经口灌服QGSX 14周，各给药剂量组大鼠的行为活动、外观体征、分泌物、粪便和动物的一般状况检查均未见明显异常。

3.2 体质量

由图1可知，与空白对照组比较，相同时间点下QGSX高、中、低剂量组的大鼠体质量无显著差异（P＞0.05），表明以临床拟推荐儿童剂量的23倍，连续给药14周，对幼龄大鼠体质量无明显影响。

图1 QGSX对各组大鼠体质量的影响Fig 1 Effect of QGSX on the body weight of rats in each group

3.3 摄食量

由图2可知，各给药组和对照组大鼠每周食耗量基本一致，表明QGSX对大鼠摄食量无明显影响。

图2 QGSX对大鼠摄食量的影响Fig 2 Effect of QGSX on the food intake of rats in each group

3.4 血常规检查

由表1可知，与空白对照组比较，QGSX高、中、低剂量组的白细胞（WBC），中性粒细胞（Neu）， 淋巴细胞（Lym），单核细胞百分比（Mon）， 嗜酸性粒细胞（Eos），嗜碱粒细胞（Bas）等指标差异无统计学意义（P＞0.05），但雌、雄性幼龄大鼠低剂量组HGB（P≤0.01）以及雌性低、中剂量组RBC（P≤0.05）差异有统计学意义。

表1 QGSX口服液对大鼠血液学指标的影响(±s)Tab 1 Effect of QGSX on the blood routine indexes of rats (±s)

表1 QGSX口服液对大鼠血液学指标的影响(±s)Tab 1 Effect of QGSX on the blood routine indexes of rats (±s)

注：与空白对照组比较，＋P≤0.05，＋＋P≤0.01（Compared with the blank control group，＋P≤0.05，＋＋P≤0.01）。

性别 组别 WBC/（×109·L－1） Neu/% Lym/% Mon/% Eos/% Bas/% RBC/（×1012·L－1）HGB/（g·L－1）雌 空白对照组 7.90±2.27 13.9±2.7 78.1±3.4 6.3±2.2 1.4±0.6 0.5±0.2 7.66±0.57 158±10 QGSX低剂量组 6.56±2.78 12.8±4.4 80.2±5.1 5.9±0.7 1.7±0.6 0.7±0.4 8.72±0.44＋＋ 177±10＋＋QGSX中剂量组 6.06±2.81 16.6±3.6 75.0±5.0 6.1±2.0 1.6±0.4 0.7±0.3 8.24±0.34＋ 165±7 QGSX高剂量组 5.97±2.02 20.9±9.7 71.4±9.6 5.4±0.8 1.8±0.4 0.5±0.2 8.06±0.39 160±8雄 空白对照组 11.54±4.46 17.2±3.6 74.6±5.5 6.0±2.1 1.6±0.4 0.5±0.2 8.82±0.39 166±8 QGSX低剂量组 13.86±2.35 16.5±4.0 69.9±4.3 6.4±1.2 1.7±0.6 0.6±0.1 9.37±0.47 178±10＋＋QGSX中剂量组 10.98±2.32 17.5±5.7 70.3±4.6 6.7±1.6 1.4±0.3 0.5±0.2 8.92±0.22 171±7 QGSX高剂量组 14.47±5.13 18.4±3.6 71.6±4.9 7.6±1.5 1.9±0.8 0.5±0.1 8.93±0.28 169±4

3.5 血液生化检查

QGSX各剂量组血液生化指标与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），该实验条件下QGSX，对幼龄大鼠的血液生化指标无明显影响，结果见表2。

表2 QGSX对大鼠血液生化指标的影响(±s)Tab 2 Effect of QGSX on the blood biochemical parameters of rats (±s)

表2 QGSX对大鼠血液生化指标的影响(±s)Tab 2 Effect of QGSX on the blood biochemical parameters of rats (±s)

生化指标ALT/（U·L－1）TBIL/（μmol·L－1）雌 空白对照组 40±5 121±38 43.0±2.9 42±7 55±4 1±0 0.28±0.30 QGSX低剂量组 43±13 109±32 41.2±3.1 43±9 56±5 1±1 0.40±0.30 QGSX中剂量组 37±6 108±12 42.5±3.2 45±12 55±5 1±1 0.21±0.13 QGSX高剂量组 34±6 88±13 44.5±2.2 47±12 56±4 1±1 0.21±0.17雄 空白对照组 39±5 101±8 36.9±1.2 78±17 56±2 1±0 0.59±0.18 QGSX低剂量组 37±5 94±7 36.8±0.8 91±12 56±1 1±0 0.63±0.21 QGSX中剂量组 36±5 103±9 35.9±0.9 90±9 55±1 1±1 0.57±0.13 QGSX高剂量组 35±7 89±12 36.9±0.9 90±8 55±1 1±0 0.61±0.24性别 组别 BUN/（mmol·L－1）性别 组别AST/（U·L－1）ALB/（g·L－1）ALP/（U·L－1）TP/（g·L－1）GGT/（U·L－1）GLU/（mmol·L－1）CRE/（μmol·L－1）TG/（mmol·L－1）CHO/（mmol·L－1）CK/（U·L－1）雌 空白对照组 8.33±1.23 39.6±5.2 6.99±0.65 0.48±0.26 1.95±0.33 993±553 QGSX低剂量组 8.95±1.30 39.5±7.2 7.66±0.96 0.52±0.38 2.46±0.70 737±315 QGSX中剂量组 8.34±0.84 38.1±3.2 7.40±1.35 0.54±0.16 2.34±0.25 859±209 QGSX高剂量组 8.96±1.66 39.2±8.0 6.35±0.67 0.45±0.16 2.18±0.31 661±196雄 空白对照组 6.37±0.56 33.6±2.0 8.21±0.93 0.76±0.42 1.93±0.37 713±136 QGSX低剂量组 6.19±0.63 35.6±4.9 8.43±1.44 0.92±0.46 1.60±0.18 820±318 QGSX中剂量组 6.07±0.40 34.1±2.5 8.87±0.82 1.13±0.58 1.68±0.21 718±135 QGSX高剂量组 6.24±0.39 34.0±3.0 8.75±0.85 0.95±0.56 1.71±0.17 756±210

3.6 BMD检测

由表3可知，与空白对照组比较，QGSX高、中、低剂量组大鼠的骨密度差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 QGSX对大鼠骨密度检测指标的影响(±s)Tab 3 Effect of QGSX on the bone marrow density parameters of rats (±s)

表3 QGSX对大鼠骨密度检测指标的影响(±s)Tab 3 Effect of QGSX on the bone marrow density parameters of rats (±s)

性别 组别 骨密度/（g·cm－2）雌 空白对照组 0.307±0.014 QGSX低剂量组 0.292±0.015 QGSX中剂量组 0.293±0.014 QGSX高剂量组 0.292±0.017雄 空白对照组 0.309±0.014 QGSX低剂量组 0.306±0.011 QGSX中剂量组 0.307±0.024 QGSX高剂量组 0.314±0.030

3.7 脏器、脏脑系数

由表4结果可知，QGSX各剂量组脏器系数与同期空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明该实验条件下QGSX，未见对幼龄大鼠主要脏器、脏脑指数造成明显影响。

表4 QGSX口服液对大鼠主要脏器系数的影响统计表(±s)Tab 4 Effect of QGSX on the main organ indexes of rats (±s)

表4 QGSX口服液对大鼠主要脏器系数的影响统计表(±s)Tab 4 Effect of QGSX on the main organ indexes of rats (±s)

性别 组别 脏器系数/（g/100 g）脑心脏 肝脏 肾脏 肾上腺 胸腺 脾脏 卵巢/睾丸 子宫/附睾雌 空白对照组 0.641±0.0460.361±0.0342.810±0.2210.606±0.0420.023±0.0030.136±0.0280.214±0.0320.033±0.0020.283±0.072 QGSX低剂量组 0.652±0.0520.372±0.0432.635±0.1790.582±0.0320.021±0.0020.131±0.0260.211±0.0310.032±0.0050.300±0.095 QGSX中剂量组 0.636±0.0660.364±0.0322.842±0.1620.594±0.0380.021±0.0020.133±0.0270.213±0.0230.037±0.0090.330±0.100 QGSX高剂量组 0.637±0.0510.355±0.0422.769±0.1840.572±0.0250.023±0.0030.134±0.0240.209±0.0280.035±0.0070.293±0.089雄 空白对照组 0.396±0.0260.337±0.0262.783±0.2410.581±0.0410.012±0.0010.104±0.0150.181±0.0270.789±0.0910.247±0.031 QGSX低剂量组 0.380±0.0180.333±0.0352.726±0.2670.569±0.0290.012±0.0010.094±0.0240.174±0.0210.749±0.0450.252±0.029 QGSX中剂量组 0.378±0.0180.322±0.0233.017±0.2680.579±0.0400.012±0.0010.088±0.0240.161±0.0200.753±0.0450.254±0.036 QGSX高剂量组 0.382±0.0210.319±0.0142.823±0.1530.578±0.0460.012±0.0010.085±0.0150.175±0.0150.786±0.0470.235±0.024

3.8 QGSX对激素指标的影响

由表5结果可知，QGSX各剂量组激素检测指标与同期空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明在该实验条件下QGSX，未见对幼龄大鼠激素指标造成明显影响。

表5 QGSX口服液对激素指标的影响(±s)Tab 3 Effect of QGSX oral liquid on the hormone indexes of rats (±s)

表5 QGSX口服液对激素指标的影响(±s)Tab 3 Effect of QGSX oral liquid on the hormone indexes of rats (±s)

激素指标GH/（pg·mL－1）性别 组别PROG/（ng·mL－1）雌 空白对照组 127.991±19.304 73.536±6.231 4.215±0.190 8.174±0.582 61.885±11.641 33.110±0.879 18.961±1.482 QGSX低剂量组 139.503±15.023 68.088±4.267 4.034±0.364 7.738±0.819 64.462±24.840 32.501±2.032 18.108±1.547 QGSX中剂量组 139.562±15.017 67.507±4.775 4.027±0.459 8.079±1.007 54.193±13.221 33.903±1.993 18.692±1.377 QGSX高剂量组 159.458±65.470 67.512±4.761 4.237±0.277 8.427±1.114 69.216±23.366 33.867±1.815 19.623±2.264雄 空白对照组 175.738±8.562 79.145±7.442 5.639±0.361 7.843±0.758 59.482±3.480 45.036±3.134 QGSX低剂量组 170.903±13.085 90.653±22.943 5.345±0.300 7.782±0.371 54.042±0.410 44.669±1.567 QGSX中剂量组 183.003±11.538 91.634±16.848 5.536±0.382 7.482±0.615 58.347±4.902 46.020±2.727 QGSX高剂量组 184.512±10.470 94.429±5.105 5.900±0.252 7.691±0.482 58.016±5.216 46.237±1.529 E/（pg·mL－1）androgen/（ng·mL－1）ACTH/（pg·mL－1）T3/T4/（ng·mL－1）（nmol·L－1）

3.9 大鼠病理组织学检查

实验结束后，对各组大鼠进行解剖，肉眼进行病理学观察，主要观察大脑、小脑、心、肝、脾、肺、肾、胸腺、卵巢、睾丸等器官的外形、体积、色泽是否正常，有无充血、出血、肿胀和坏死等异常现象。结果发现，各给药组与空白对照组大鼠的各脏器均未见任何异常。

取高剂量组和空白对照组大鼠的大脑、小脑、心、肝、脾、肺、肾、胸腺、卵巢、睾丸等脏器以福尔马林固定，石蜡切片，镜检各脏器的组织学结构变化。结果表明，高剂量与空白对照组大鼠的各脏器组织学结构清楚，未见明显异常，结果表明，QGSX该实验条件下，未见对幼龄大鼠主要脏器外观形态及组织结构造成明显影响（见图3）。

图3 大鼠主要脏器组织病理学（200×）Fig 3 Histopathology of main organs of rats （200×）

4 讨论

儿童是特殊用药人群，为保障其用药安全，对QGSX开展临床前儿童用药安全性评价具有重要的现实意义。重复给药毒性实验研究是药物临床前安全性评价重要内容之一，将药物按照临床用药途径大剂量多次给药，密切检测动物产生的毒性反应和中毒靶组织器官，能够获得毒性产生的量效和时效关系，预测药物在临床上可能出现的毒性反应性质及发生率，对药物的临床应用具有重要的参考意义[9-10]。在药物安全性评价中，药物作用常会引起动物一些器官质量的减少，根据脏器系数来检验动物的脏器是否受到药物的不良影响[11]，根据血液学指标判定药物是否具有毒性[12]，根据血液生化指标判定药物对主要脏器是否有毒性作用[13]。

本幼龄SD大鼠重复给药毒性试验结果表明，QGSX重复给药14周对幼龄SD大鼠三个剂量下的临床表现、体质量、摄食量、骨密度、血液生化指标、激素指标、脏器系数均无明显影响，组织病理学检查结果亦显示，三个剂量下未见明显的毒性靶器官。与空白对照组比较，大鼠骨密度指标无显著差异，可能与机体对大剂量钙的吸收利用度有限有关，实际临床中采取维生素D与钙同补，以提高钙的吸收利用度。与空白对照组比较，血常规指标中，给药末期给药组雌雄大鼠低剂量组HGB明显高于同期空白对照组，雌性大鼠低、中剂量组RBC明显高于同期空白对照组，临床上以HGB、RBC作为缺铁性贫血诊断指标，结合前期药效学研究发现QGSX具有上调骨髓微环境中血管内皮生长因子（VEGF）、血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1）蛋白表达，调节骨髓有核细胞周期，促进骨髓细胞分裂，调节骨髓细胞中有核细胞数，直接升高HGB与RBC的药理作用[14]，因此可认为该变化与供试品药理作用相关，无明显毒理学意义。高剂量幼龄大鼠GH指标虽无明显差异，但极差较大，可以归因于幼龄大鼠处于发育期，动物本身存在个别差异，特别是激素水平的变化。

综上所述，通过本研究结果可得出QGSX幼龄大鼠重复给药14周最大无毒反应剂量为12 g生药·kg－1，约相当于儿童临床拟用公斤剂量的23倍（1岁儿童按体质量10 kg计算）。提示本品临床应用安全范围较大，安全窗较宽。