许梦荣，王川*，路鹏鹏，李庆智，梁涛，常卓琳，徐仓宝，张恩户*（.陕西中医药大学药学院/陕西省中医药管理局中药药效机制与物质基础重点研究室，陕西 咸阳 7046；.西安医学院基础与转化医学研究所/陕西省缺血性心血管疾病重点实验室，西安 700）

吸烟严重危害人类健康。吸烟不仅是当今世界上最严重的公共卫生问题，也是人类健康面临的可预防的最严重危险因素[1]。香烟燃烧时释放出的物质多达4000种，有害物质主要有尼古丁、一氧化碳、氢氰酸、亚硝胺、内毒素、苯并芘等[2-3]。香烟烟雾在肺部激活炎性细胞，释放炎症介质进入血液循环影响心血管功能；也可以激活交感神经系统，引起儿茶酚胺释放增加，心率加快，动脉痉挛，血压升高；部分烟雾颗粒物也能直接穿过肺泡壁进入肺循环系统，与心血管系统直接作用[4-6]。吸烟是动脉粥样硬化、高血压、冠心病、中风等多种心血管疾病的重要危险因子[7-8]，甚至能引起吸烟者的血管功能明显紊乱[9]，据统计，冠心病和高血压病患者中大约75%有吸烟史[10]。肾上腺素α1受体在心血管疾病中起重要作用，与心血管疾病中的血管收缩有关[11]。交感神经兴奋时释放去甲肾上腺素，激动肾上腺素α1受体，收缩血管。有研究表明，高血压患者血管对肾上腺素α1受体激动剂介导的收缩作用增强[12]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是细胞应激和损伤反应的主要信号通路，介导细胞生长、增殖、分化、死亡等多种生理和病理过程[13]。ERK1/2-MAPK信号通路的激活与动脉高反应性密切相关[14]，研究表明吸烟损伤动脉血管细胞，激活ERK1/2和NF-κB通路，使动脉血管平滑肌内皮素受体表达上调，导致动脉血管平滑肌呈现高反应性，ERK1/2信号通路也参与肾上腺素α1受体的调节作用，弱氧化型低密度脂蛋白激活 ERK1/2 信号转导通路引起TNF-α和 IL-1β水平增高，上调小鼠肠系膜动脉肾上腺素α1受体，并且引起 肾上腺素α1受体介导血管收缩增强[15]。AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）是生物能量代谢调节的关键分子，AMPK的激活能够调节能量代谢，具有心血管保护作用[16]。然而，香烟烟雾颗粒调节肾上腺素α1受体的作用机制还不十分清楚。研究香烟烟雾颗粒对肠系膜动脉肾上腺素α1受体的作用，对阐明吸烟致病机制有重要意义，本研究拟从大鼠肠系膜动脉平滑肌收缩功能考察香烟烟雾颗粒诱导肾上腺素α1受体在动脉高反应性中的作用及其相关信号通路。

1 材料

1.1 试药

苯肾上腺素（PE）、乙酰胆碱（ACh）、二甲基亚砜（DMSO）、U0126、BAY 11-7082、AICAR、曲拉通X-100（Triton X-100）（Sigma公司）；肾上腺素α1受体抗体（Abcam）；β-actin、HRP Goat anti-Rabbi二抗（碧云天生物技术公司）。Na＋-PSS缓冲 液（mmol·L－1）：NaCl 119，NaHCO315，KCl 4.6，MgCl21.2，NaH2PO41.2，CaCl21.5和葡萄糖5.5（自制）；60 mmol·L－1K＋-PSS缓冲液为将Na＋-Krebs液中的NaCl换成相同摩尔浓度的KCl（自制）。DMEM高糖培养基（美国Hyclone，Cat No：SH30022.01）。

1.2 动物

SPF级雄性SD大鼠，10～12周龄，体质量（300±20）g [西安交通大学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK（陕）2015-003]。动物饲养于西安医学院基础转化医学院研究所动物饲养室，室温20～22℃，相对湿度（40±5）%，自由饮食饮水。

1.3 仪器

SZ51体视显微镜（日本奥林巴斯）；离体组织浴槽系统（丹麦DMT620）；CO2培养箱（美国Thermo Scientific）；肌张力描记记录系统（澳大利亚AD Instruments）；电泳仪、转膜仪、凝胶成像系统（美国Bio-RAD）。

2 方法

2.1 香烟烟雾颗粒二甲基亚砜溶解物（DSP）的制备

实验在负压条件下进行，将点燃的3支香烟（市售，尼古丁含量0.8 mg，焦油含量11 mg）通过负压使烟雾经过脱脂棉球，充分吸收烟雾后将脱脂棉球取出浸入1 mL DMSO中，使其充分溶解在DMSO中，过0.22 μm过滤器除菌，即得DSP[17]。

2.2 动脉组织培养

雄性SD大鼠断颈处死后，无菌条件下迅速分离出大鼠肠系膜，浸泡于过滤除菌并预冷的Na＋-PSS缓冲液中，显微镜下分离出肠系膜动脉，0.1% Triton X-100血管内灌注10 s，去除血管内皮，剪成约1.5 mm的动脉环，放入24孔培养板内进行培养，每孔加入1 mL 不含血清的DMEM高糖培养基，通过不同实验设计要求在培养基中加入DSP或溶剂对照DMSO及相应的信号通路阻断剂（U0126、BAY 11-7082）或激活剂（AICAR）[16]。将培养板置于37℃含5% CO2气体的培养箱内，根据实验要求培养不同的时间，每隔24 h更换一次培养基。

2.3 离体肌张力描记

将5 mL 的Na＋-PSS放入恒温离体浴槽DMT内，并将含95% O2和5% CO2的混合气体不断通入恒温离体浴槽内，用两根呈L型的钢针将动脉环穿插连接起来，一根钢针连接在张力传感器上，另外一端则与微调装置相连[17-19]。动脉环每隔20 min施加0.5 mN的预张力，直至2 mN，血管环平衡40 min后，加入K＋-PSS缓冲液（60 mmol·L－1K＋），检验动脉环收缩活性，若血管环在两次K＋-PSS液中的收缩幅度均大于 5 mN并且两次收缩差异低于10%时，该血管环用于下一步实验，待第二次高浓度的K＋-PSS缓冲液引起的收缩稳定后加入ACh，若ACh引起的舒张率＜10%，认为动脉内皮已被去除[18-19]。采用浓度累加法加入PE（1×10－9～1×10－4mol·L－1），考察肾上腺素α1受体介导的收缩反应。

2.4 Western blot

取培养24 h的血管，提取组织总蛋白，BCA法检测样品蛋白含量。蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的Tris-盐缓冲液（TBST）室温封闭1 h，加入一抗（肾上腺素α1受体、p-ERK、ERK抗体及内参β-actin）4℃过夜，之后加入HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗涤，加入增加化学发光底物（ECL），使用化学发光成像系统检测，检测目标带的分子量和光密度值，分析相关蛋白表达。

2.5 统计学分析

所有数据用均数±标准差表示。收缩性激动剂在动脉环上引起的收缩用60 mmol·L－1的K＋-PSS引起的收缩的百分数表示。使用IBM SPSS Statistics 25.0软件采用单因素方差分析（ANOVA）进行多组数据间的比较[17]。

3 结果

3.1 DSP对肾上腺素α1受体介导的收缩反应的影响

使用0.1、0.2和0.4 μL·mL－1DSP（1 mL培养基中加入0.1、0.2、0.4 μL的DSP，即得）与动脉环共培养24 h，梯度累加法加入选择性肾上腺素α1受体激动剂PE，得累积浓度-反应曲线见图1。不同浓度的DSP均能诱导大鼠肠系膜动脉血管环收缩，且收缩反应呈浓度依赖性。与溶剂对照DMSO组相比，0.1 μL·mL－1DSP对去肾上腺素α1受体介导的气管累积浓度-反应曲线没有明显的影响，而DSP 0.2 μL·mL－1和DSP 0.4 μL·mL－1组肾上腺素α1受体介导的累积浓度-反应曲线显著左移（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot结果表明，DSP 0.2 μL·mL－1和DSP 0.4 μL·mL－1组均使肾上腺素α1受体的表达升高（P＜0.01）。因此后续实验DSP浓度选择为DSP 0.2 μL·mL－1。

图1 DSP对PE介导的累积浓度-反应曲线的影响（A）及肾上腺素α1受体蛋白的表达（B）（±s，n＝6～8）Fig 1 Effect of DSP on cumulative concentration-reaction curve induced by PE（A）and expression of α1-adrenoceptor protein（B）（±s，n＝6～8）

3.2 ERK1/2信号通路抑制剂U0126对肾上腺素α1受体介导的收缩反应的影响

为了考察ERK1/2信号通路是否参与了DSP引起的肠系膜动脉收缩，在培养时加入特异性ERK1/2信号通路抑制剂U0126（10 μmol·L－1）与0.2 μL·mL－1DSP共培养24 h。结果如图2所示，与DSP组相比，ERK1/2信号通路抑制剂U0126可以显著性抑制肾上腺素α1受体激动剂PE诱导的收缩反应（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot结果表明U0126可以降低肾上腺素α1受体的蛋白表达。DSP组p-ERK1/2蛋白的表达升高，表明DSP通过激活p-ERK1/2上调肾上腺素α1受体。DSP＋U0126组抑制了DSP诱导的肾上腺素α1受体上调。以上结果表明ERK1/2-MAPK信号通路可能参与了DSP上调肾上腺素α1受体引起的血管收缩。

图2 ERK1/2抑制剂U0126对PE介导累积浓度-反应曲线（A）的影响及肾上腺素α1受体蛋白的表达（B）（±s，n＝7～9）Fig 2 Effect of ERK1/2 inhibitor U0126 on cumulative concentrationreaction curve induced by PE（A）and expression of α1 adrenoceptor protein（B）（±s，n＝7～9）

3.3 NF-κB 通路抑制剂BAY 11-7082对肾上腺素α1受体介导的收缩反应的影响

为了研究NF-κB是否和DSP诱导PE引起的收缩增强有关，加入0.2 μL·mL－1DSP和NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-7082（10 μmol·L－1）与动脉环共培养24 h。图3结果显示，与DSP组相比，NF-κB信号通路抑制剂BAY-117082不能消除DSP诱导PE增强血管收缩的作用。

图3 NF-кB抑制剂BAY 11-7082对PE介导的累积浓度-反应曲线的影响（±s，n＝9）Fig 3 Effect of NF-кB pathway inhibitor BAY 11-7082 on cumulative concentration-reaction curve induced by PE（±s，n＝9）

3.4 AMPK信号通路激活剂AICAR对肾上腺素α1受体介导的收缩反应的影响

为了研究AMPK信号通路是否参与了DSP引起的肠系膜动脉收缩，在培养时加入特异性AMPK信号通路激活剂AICAR（500 μmol·L－1）与0.2 μL·mL－1DSP共培养24 h。图4结果表明，与DSP组相比，AICAR对DSP引起肾上腺素α1受体上调没有明显的影响，表明AMPK信号通路可能没有参与DSP诱导肾上腺素α1受体介导的收缩反应。

图4 AMPK激活剂AICAR对PE介导累积浓度-反应曲线的影响（±s，n＝8～10）Fig 4 Effect of AMPK pathway agonist AICAR on cumulative concentration-reaction curve induced by PE（±s，n＝8～10）

4 讨论

吸烟与动脉高反应性密切相关，然而吸烟导致动脉高反应性的分子机制还不清楚。香烟烟雾不仅导致高血压、冠心病、中风、动脉粥样硬化等一系列心血管疾病，还可引起血管的收缩及舒张功能失调造成相关的心血管疾病[14]。交感神经兴奋，末梢释放肾上腺素，激动血管平滑肌细胞膜上的肾上腺素受体，引起收缩血管，血管平滑肌的收缩功能是影响血管阻力的一个重要因素[20]。

本实验用离体器官培养技术，从大鼠肠系膜动脉平滑肌收缩功能研究DSP诱导肾上腺素α1受体在血管高反应性中的变化及其相关信号通路。笔者发现DSP可引起大鼠肠系膜动脉平滑肌的肾上腺素α1受体介导的血管环收缩反应增强，肾上腺素α1受体表达增加，且呈浓度依赖性，该现象可能与DSP诱导的肾上腺素α1受体上调有关。

U0126是ERK1/2通路特异性抑制剂，抑制MEK，阻断MEK1/2激酶激活，抑制下游ERK1/2 激酶激活。DSP增强血管收缩的作用及上调肾上腺素α1受体的表达可以被ERK1/2抑制剂U0126抑制，表明DSP上调肾上腺素α1受体的作用可能与ERK1/2信号通路有关。

NF-κB是MAPK下游的重要转录因子之一，BAY 11-7082是一种IκBα磷酸化和NF-κB抑制剂，选择性且不可逆地抑制IκB-α磷酸化，并减少NF-κB和黏附分子的表达，本研究发现BAY 11-7082不能消除DSP诱导PE增强血管收缩的作用，AMPK的激活具有保护心血管的作用，AICAR是AMPK的激活剂，能在细胞内转换为AMP类似物环腺苷-磷酸衍生物（ZMP），从而激活AMPK。本实验使用AICAR和DSP共培养，结果表明AICAR不能逆转DSP引起的收缩，提示DSP上调肾上腺素α1受体引起的收缩增强可能与NF-κB和AMPK通路无关。

DSP可以诱导动脉血管平滑肌细胞肾上腺素α1受体上调，导致动脉血管平滑肌对肾上腺素α1受体PE刺激呈高反应性、动脉血管收缩增强。ERK1/2信号通路将信息从细胞表面传递到细胞内，再转导到细胞核，激活转录因子，介导生物学效应[21-23]。DSP激活ERK1/2信号转导通路，可能激活其介导的转录和翻译机制，合成新的肾上腺素α1受体，使动脉血管平滑肌肾上腺素α1受体表达上调，导致动脉血管平滑肌呈现高反应性。因此，阻断ERK1/2信号转导通路，可以抑制肾上腺素α1受体介导的收缩反应，改善动脉血管高敏感性和平滑肌高反应性，达到治疗血管痉挛性疾病的目的。

本课题通过研究DSP对肾上腺素α1受体介导的血管高反应性的影响及机制，为血管高反应性疾病提供新的治疗靶点。本研究结果提示开发控制细胞内ERK1/2信号通路的相关药物是治疗血管高反应性疾病的新思路。