王雪蕊 郭玉红 徐霄龙 白云静 刘清泉

摘要 目的：從自由基来源和清除的角度探讨针刺对自发性高血压大鼠（SHR）延髓头端腹外侧区（RVLM）中氧化应激水平影响的潜在机制。方法：15只Wistar（WKY）大鼠为正常组，45只SHR大鼠随机分为高血压组、针刺组和非穴组。针刺组取“太冲穴”直刺，非穴组取非穴位浅刺，治疗1次/d，共14 d。采用遥测技术检测针刺对血压的影响;采用DHE染色检测针刺对RVLM中活性氧族（ROS）变化的影响;采用化学发光法检测针刺对RVLM中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮合酶（NOS），和NADPH氧化酶活性的影响;采用Western Blot检测针刺对RVLM中NADPH氧化酶、SOD、NOS各亚基或亚型蛋白表达的影响。结果：与正常组比较，高血压组大鼠收缩压显著增高（P<0.05），RVLM中ROS产生增多（P<0.05），NADPH氧化酶活性增高（P<0.05），其亚基gp91phox、p22phox和nNOS蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与高血压组和非穴组比较，针刺干预可显著下调SHR大鼠的收缩压（P<0.05），降低RVLM中ROS的水平（P<0.05），下调NADPH氧化酶活性（P<0.05）。各组中SOD和NOS活性，SOD1、SOD2和iNOS蛋白表达水平无显著改变。结论：针刺可显著改善SHR大鼠血压，降低RVLM中ROS的水平，其机制可能与下调NADPH氧化酶亚基gp91phox、p22phox、及NOS亚型nNOS的表达水平相关。

关键词 高血压;针刺;氧化应激;延髓头端腹外侧区;大鼠

Effects of Acupuncture on Oxidative Stress in the Rostral Ventrolateral Medulla of Spontaneously Hypertensive Rats

WANG Xuerui，GUO Yuhong ，XU Xiaolong，BAI Yunjing，LIU Qingquan

（Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Capital Medical University，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To explore the potential mechanism of acupuncture on oxidative stress level in the rostral ventrolateral medulla （RVLM） of spontaneously hypertensive rats （SHR） from the perspective of free radical source and elimination.Methods：A total of 15 Wistar （WKY） rats were in the normal group，and 45 SHR rats were randomly divided into a model group，an acupuncture group and a non-acupoint group.In the acupuncture group，“Taichong” acupoints were used for treatment once a day for 14 days.In the non-acupoint group received superficial needling was used.The effects of acupuncture on blood pressure were measured by telemetry; the effects of acupuncture on the changes of reactive oxygen species （ROS） in RVLM were detected by DHE staining; the effects of acupuncture on the activities of superoxide dismutase （SOD），nitrogen synthase （NOS） and NADPH oxidase activity in RVLM were detected by chemiluminescence; and the effects of acupuncture on the subunits or subunits expression of NADPH oxidase，SOD and NOS in RVLM were detected by Western Blot.Results：Compared with the normal group，the systolic blood pressure of the model group was significantly increased （P<0.05），ROS production in RVLM increased （P<0.05），the NADPH oxidase activity increased （P<0.05），and the protein expression levels of gp91phox，p22phox and nNOS were significantly increased （P<0.05）.com

pared with the model group and non-acupoint group，acupuncture intervention could significantly down-regulate the systolic blood pressure of SHR rats （P<0.05），the level of ROS in RVLM （P<0.05），and the activity of NADPH oxidase （P<0.05）.There was no significant change in the SOD and NOS activities，the protein expression of SOD1，SOD2 and iNOS among each groups.Conclusion：Acupuncture could significantly reduce high blood pressure and ROS levels in the RVLM of SHR rats.The mechanism may be related to the down-regulation of the expression of NADPH oxidase subunits gp91phox，p22phox and NOS subtype nNOS.

Keywords Hypertension; Acupuncture; Oxidative stress; Rostral ventrolateral medulla; Rats

中图分类号：R245文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.012

高血压病是最为常见的心血管疾病之一，目前我国约有患者2亿人，其造成的靶器官损害严重影响了人民群众的健康[1]。既往研究发现，氧化应激是影响高血压发生发展和导致靶器官损伤的关键因素[2-3]。生理状态下，体内氧化和抗氧化系统维持动态平衡，防止活性氧族（ROS）对机体的损害。在高血压的病理状态下，机体或细胞内氧自由基的产生和消除失衡导致ROS在过量蓄积，从而引起氧化应激。ROS的主要来源包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，其他来源包括一氧化氮合成酶脱偶联（NOS）等。机体各组织包括血清中也包含有一定活性的抗氧化酶系，可及时有效地清除ROS。其中，超氧化物歧化酶（SOD）是体内含量最为广泛的抗氧化剂，可以通过清除自由基防止靶器官的氧化损伤。在高血压的病理状态下，中枢内增多的ROS引起的氧化应激通过刺激延髓头端腹外侧区（RVLM）交感神经元，引起交感神经兴奋性传出增加，导致血压升高[4-5]。研究表明，通过脑定位在RVLM中注射SOD模拟物Tempol、特异性基因敲低神经性一氧化氮合酶等方法来降低RVLM中的氧化应激水平，均可显著降低交感神经兴奋性，改善血压[6-7]。针灸是中医药中非常有代表性的一类治疗方法，已有大量研究发现针灸疗法可以下降高血压患者的血压或改善其相关症状[8-11]。在机制研究中同样发现者针刺治療可改善自发性高血压大鼠（SHR）血压[12-14]。本研究旨在从ROS产生来源和清除能力两方面，研究针刺对机体内NADPH氧化酶、NOS活性和SOD活性的调节作用，探讨针刺对中枢系统氧化应激调节的机制，为扩大针灸的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SHR和WKY大鼠，体质量均为180～220 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证编号：SCXK（京）2006-009），由北京市中医研究所专人饲养。45只SHR采用随机数字表法分为高血压组、针刺组、非穴组，每组15只。15只WKY大鼠作为正常组。实验过程符合北京市中医研究所动物伦理。

1.2 试剂和仪器

无线生理信号遥测系统（型号：植入式DSCF-08）和心电植入子（型号：ECG-DSCF-FS01）均购买于北京软隆生物技术有限公司;

SOD测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，型号：A001-3-2），总NOS测试盒（南京建成生物工程研究所，型号：A014-2-2），NADPH氧化酶活性测试盒（南京建成生物工程研究所，型号：A127-1-1），BCA蛋白定量试剂盒（abcam，英国，型号：ab102536），反转录试剂盒（美国赛默飞，美国，型号：Q1010）。

1.3 方法

1.3.1 针刺操作

根据华兴邦动物穴位图谱选取穴位，针刺组选取双侧太冲穴。太冲穴定位为大鼠后肢足背侧第1、2跖骨间凹陷处;非穴点定位为大鼠后肢足背侧第3、4跖骨间凹陷处。大鼠非麻醉状态下进行针刺操作，穴位组直刺法30 s，留针10 min。非穴组浅刺不行手法，留针10 min。针刺组及非穴组1次/d，连续14 d。其他组与针刺组和非穴组进行相同时间、相同程度的捉抓刺激。

1.3.2 DHE染色

收取各组大鼠大脑组织OCT冰冻包埋剂包埋，冠状位厚度为10 μm连续冰冻切片。将所有包含RVLM的切片按顺序放置于装有冻存液的24孔反应板内，Triton破膜后进行DHE染色。在荧光显微镜下观察并拍片，并用Image-Proò Plus（IPP）6.0图像分析软件对荧光强度进行定量分析，结果以相对ROS荧光强度单位表示。

1.3.3 SOD活性、NOS活性和NADPH氧化酶检测  化学法检测SOD、NOS和NADPH氧化酶活性。在冰上快速分离各组RVLM组织，在低温下匀浆后采用BCA法测定蛋白浓度。10 μL蛋白上清液混合10 μL Lucigenin和980 μL Krebs液，测量个样本在340 nm波长的吸光度，反应期后每30 s记录一次数值，并计算其平均值，为其活性：平均值×2/蛋白浓度。单位为RLU/min/mg protein，RLU=Relative Light Unit。

1.3.4 Western Blot法检测

别收取不同组RVLM组织匀浆后，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法检测总蛋白的浓度。采用10%浓度凝胶进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后进行转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入NADPH氧化酶亚基gp91phox、p22phox，SOD亚型SOD1、SOD2，NOS亚型诱导型一氧化氮合酶（Inducible Nitric oxide Synthase，iNOS）、神经型一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，nNOS）一抗（1∶1 000），4 ℃摇床过夜。加入对应荧光二抗对硝酸纤维膜上的蛋白进行测定，GAPDH作为参比蛋白，检测信号经Odssey远红外成像仪进行分析蛋白表达量变化。Image J对灰度进行分析统计。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，数据符合正态分布以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并用Turkey法作组间多重比较。以P<0.05为差异有统计学意义。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 针刺不同时间点对自发性高血压大鼠收缩压的影响

针刺治疗后不同时间点各组大鼠收缩压见图1。与正常组比较，高血压组大鼠收缩压随着时间推移逐渐增高，在第14天达到高峰（P<0.05）。与高血压组比较，针刺治疗显著下降了SHR的收缩压，于第8天开始有统计学意义（P<0.05）。与非穴组比较，针刺显著下调SHR大鼠的收缩压（P<0.05）。

2.2 针刺下调延髓头端腹外侧区ROS水平

针刺治疗14 d后各组大鼠RVLM中ROS水平见图2。与正常组比较，高血压组大鼠RVLM中ROS荧光强度显著升高（P<0.05）。与高血压组和非穴组比较，针刺治疗显著降低了SHR RVLM中ROS的产生水平（P<0.05）。

2.3 针刺对自发性高血压大鼠延髓头端腹外侧区SOD活性、NOS活性和NADPH氧化酶活性的影响  针刺治疗14 d后各组大鼠RVLM中SOD活性、NOS活性和NADPH氧化酶活性见图3。与正常组比较，高血压组RVLM中NADPH氧化酶活性上调显著（P<0.05）。与高血压组和非穴组比较，针刺治疗显著降低NADPH氧化酶活性（P<0.05）。而SOD活性和NOS活性在各组中差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 针刺对自发性高血压大鼠延髓头端腹外侧区NADPH氧化酶、SOD、NOS各亚基或亚型蛋白表达的影响

针刺治疗14 d后取各组大鼠RVLM组织，采用Western Blot法检测各组大鼠组织中NADPH氧化酶亚基gp91phox、p22phox，SOD亚型SOD1、SOD2和NOS亚型iNOS、nNOS的蛋白表达水平。结果见图4和表1，与正常组比较，高血压组大鼠NADPH氧化酶亚基gp91phox和p22phox，以及NOS亚型nNOS蛋白表达水平升高显著（P<0.05）。与高血压组比较，针刺治疗显著降低了gp91phox、p22phox、nNOS蛋白表达水平（P<0.05）。与针刺组比较，非穴组gp91phox蛋白表达显著上调（P<0.05）。SOD1、SOD2和iNOS蛋白表达水平在各组中差异无统计学意义。

3 讨论

高血压为当今世界最常见的心血管疾病之一，2010年中国慢性病监测调查显示中国高血压患者人数约为3.3亿[15]。升高的血压是多种急危重症疾病如心肌梗死、心脏衰竭、脑卒中等的常见危险因素[16]。针灸疗法是传统医学的代表性疗法，既往研究发现其对高血压具有改善作用[8-11]。高血压在中医学中归属于“眩晕”“头痛”等范畴。《素问·至真要大论篇》记载“诸风掉眩，皆属于肝”，指出本病的发生责之于肝。本研究选择太冲穴作为主穴，太冲穴为足厥阴肝经原穴，具有清泻肝火、平肝潜阳等作用，是临床治疗高血压的常用穴位。郝婷等利用复杂网络分析等方法探索针刺治疗原发性高血压腧穴配伍规律，发现以太冲穴、曲池穴、足三里穴等为主的临床常用治疗原发性高血压核心腧穴组合，其中太冲穴是应用频次和频率最高的主穴位[17]。前期动物实验也发现，单穴刺激太冲穴对于SHR血压的调节作用优于单穴刺激足三里穴、百会穴、或非穴[12]。我们的实验发现，针刺太冲穴可显著下调SHR收缩压，而非穴组却无此疗效。本研究旨在从氧化应激的角度探讨针刺的降压机制。

氧化应激机体最为常见的损伤反应，是指机体对组织产生的自由基清除过少、或产生过多导致ROS蓄积造成的氧化损伤过程。高血压的发病机制和发生发展过程与氧化应激密切相关。据报道，高血压患者体内氧化/抗氧化失调，引起氧化应激，不仅可以损伤外周血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等，也会作用于中枢RVLM等多个核团，引起交感神经兴奋性增加，血压升高[4-5]。利用NADPH氧化酶抑制劑、SOD模拟物等抗氧化剂在RVLM中注射，可以降低RVLM中的氧化应激水平，改善升高的血压[6-7]。我们的结果发现，与正常组比较高血压大鼠RVLM中ROS的水平增高，针刺能显著下调RVLM中ROS的水平，提示针刺的降压作用可能与调节中枢氧化应激水平有关，但是针刺对氧化应激的调节机制是否与活性氧的产生和清除动态平衡有关，仍有待进一步探讨。

多种因素都能影响ROS的生成与清除的动态过程，从而调节氧化应激。其中NADPH氧化酶及NOS是最常见的自由基来源，而SOD则体内是清除自由基的最常见抗氧化剂。NADPH氧化酶被称为ROS生成的“专业户”[18]。该酶是由膜亚基 gp91phox和p22phox，胞浆亚基p47phox、p67phox、p40phox和Rac等结合组成的酶复合体，负责将电子转移给O2形成O2-从而产生ROS[19]。研究发现在大脑核团中NADPH氧化酶亚基均可可检测到表达，且以gp91phox催化亚基形成的NADPH同源物NOX2功能最为显著[20]。我们的研究发现，NADPH氧化酶活性在高血压大鼠RVLM中显著上调，针刺干预可降低NADPH氧化酶活性，并下调NADPH亚基gp91phox、p22phox的蛋白表达水平，说明针刺对氧化应激动态平衡调节的机制可能主要与其对NADPH氧化酶介导的氧化应激调节有关。NOS通过特异性催化底物L-精氨酸合成NO，是NO的主要来源。NO广泛分布于中枢神经系统内，作为细胞信使分子参与血管张力及局部血流的调节，是体内重要的抗氧化及抗高血压保护因子。NOS的亚型中nNOS和iNOS具有神经毒性作用。我们的结果发现，针刺后RVLM中NOS活性和iNOS的蛋白表达没有显著改变，但nNOS的蛋白表达水平显著下调，说明针刺对NOS介导的氧化应激可能存在一定的调节作用。SOD是体内最广泛分布的抗氧化酶，通过调节超氧阴离子的氧化还原反应进行ROS的有效清除。我们的结果发现高血压大鼠RVLM中SOD活性没有显著变化，针刺干预对其没有显著的调节作用。SOD亚基SOD1和SOD2的蛋白表达水平在针刺前后没有显著变化，说明针刺对RVLM中氧化应激的调节作用可能与增强自由基的清除效应无关。综上所述，我们从自由基来源和清除的角度，发现针刺对RVLM中ROS具有调节作用。且针刺对脑内氧化应激的调控作用可能具有多条途径相关，尤其是对NADPH氧化酶介导的氧化应激具有调节作用。但针刺选择性调节NADPH氧化酶、SOD、NOS的具体机制是什么，仍有待未来深入的研究。

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（2019-10-16收稿 责任编辑：徐颖）

基金项目：国家自然科学基金青年项目（82004292）;国家自然科学基金面上项目（81973608）;国家自然科学基金专项项目（62041701）;国家科技重大专项（2017XZ10305501）;科技部公共安全风险防控与应急技术装备专项（2020YFC0841600）通信作者：刘清泉（1965.11—），男，学士，主任医师，研究方向：中西医结合急危重症，Tel：（010）52176095，E-mail：liuqingquan_2003@126.com