周 薏，葛冰景，肖铁刚，曹红燕，戴彦成，阙任烨

(上海中医药大学附属上海市中西医结合医院脾胃病科，上海 200082)

肝纤维化是一种动态可逆性的病理过程，若未采取有效措施进行干预，甚至可进展为肝硬化，严重危害人类的健康。肝脏铁过载在肝纤维化发生机制中具有重要作用，它能够诱发或加重疾病的发展，随着铁过载的持续，最终可导致肝硬化，甚至肝癌发生[1-2]。临床上使用铁螯合剂也显示出明显的改善肝纤维化指标作用[3]。中医学认为铁是体内的精微物质之一，而精微物质的转运离不开脾之运化功能和肝之疏泄功能的正常发挥。因此，铁代谢紊乱反映的是肝失疏泄，脾运失常。临床上肝纤维化或肝硬化患者常常存在肝失疏泄，脾运无权等情况，以致不能将铁转运至血液循环中为造血器官所利用，引起贫血，并沉积于肝脏等器官，引起纤维化的发生。故肝纤维化的治疗应着眼于疏肝健脾。逍遥散是中医学疏肝健脾的经典名方，由四逆散及当归芍药散化裁而成。有多项临床与实验研究表明逍遥散具有抗肝纤维化的作用[4-6]，但其机制尚不明确。本课题组前期通过对逍遥散联合恩替卡韦治疗肝郁脾虚型乙肝后肝硬化代偿期患者的随机对照研究中发现，逍遥散具有显著的改善纤维化作用，并能够改善患者机体的铁过载水平。因此，本研究拟通过右旋糖酐铁诱导铁过载所致大鼠肝纤维化模型，观察逍遥散的抗肝纤维化作用是否与调节体内铁代谢平衡有关。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

1.1.1 实验动物 清洁级雄性SD成年大鼠，56只，体质量180～220g，购自上海市实验动物中心，动物合格证号SCXK(沪)2013-0016，饲养于上海市中医医院无特异病原体(SPF)级动物房，恒温(25±2)℃恒湿，人工光照12 h，黑暗12 h，自由进食饮水，本研究中的动物实验规程遵循“实验动物关爱和使用指南”。

1.1.2 试剂 COL-1、α-SMA免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物科技有限公司，苏木素-伊红染色液(P031IH)购于湖南艾佳生物科技股份有限公司，Masson染色液(G1340)购于北京索莱宝科技有限公司，天狼星红染色液(DC0041)购于北京雷根生物技术有限公司，铁标准溶液1 000 μg/mL由国家标准物质中心提供。

1.1.3 药物配制 逍遥散准确称取柴胡15 g，当归15 g，白芍 15 g，白术 15 g，茯苓 15 g，甘草 7.5 g，粉碎成粗粉，加水1 500 mL煮沸，保持沸腾20 min，加入5 g煨姜和5 g薄荷，再保持沸腾煎煮10 min，煎煮液过5层纱布，滤液浓缩至2 g/mL(按生药量计)，经冷冻干燥制成粉末，用前以蒸馏水配制成混悬液。去铁胺配置成浓度为0.45 g/kg的去铁胺溶液，逍遥散各拆方组按逍遥散去疏肝药组(去柴胡、薄荷)、逍遥散去健脾药组(去茯苓、白术、甘草)、逍遥散去养血药组(去当归、白芍)制作药物混悬液，方法同上。

1.1.4 仪器 快速研磨仪JXFSTPRP-48(上海净信实业发展有限公司)，多功能酶标仪Varioscan Flash(上海百基生物科技有限公司)，RM2016切片机(莱卡公司)，生物组织摊烤片机YT-6C(亚光医用电子技术有限公司)，防脱载玻片P031IH(湖南艾佳生物科技股份有限公司)，鼓风干燥箱DHC-9070A(天津津立仪器设备科技发展有限公司)，光学显微镜AE41(麦克奥迪实业集团有限公司)，AU400型全自动生化分析仪(日本奥林巴斯公司)，JENA AA400型原子吸收分光光度计(德国JENA仪器公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及模型建立 将56只SD大鼠随机分为对照组、模型组、逍遥散全方组、逍遥散去疏肝药组、逍遥散去健脾药组、逍遥散去养血药组、去铁胺组，模型制作方法参照文献[7]进行，每日予腹腔注射50 mg/kg右旋糖酐铁，连续7周，对照组予腹腔注射同等剂量的生理盐水。各药物干预组在造模同时给予灌胃各组对应的治疗药物10 mL/(kg·d-1)灌胃，对照组及模型组按体质量给予灌胃等量生理盐水。所有组大鼠7周后处死，取血清、肝组织标本。血清标本用蛋白酶抑制剂处理，-20℃中保存备用；用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、SI、SF。肝组织标本用含0.01%DEPC的生理盐水清洗后保存于-80℃中，部分标本用中性福尔马林固定12 h后经石蜡包埋，3～5 μm厚连续切片备检。

1.2.2 肝脏病理组织检查 病理组织学采用HE染色、Masson染色、苦味酸-天狼星染色3种染色方法，取备检石蜡切片经脱蜡、水化、染色、分化、透明、封片、镜检，分别观察病变与纤维化程度，使用Ishak评分对HE染色切片进行量化比较，ImagePro Plus软件进行半定量分析Masson染色、苦味酸-天狼星染色结果。

1.2.3 免疫组化检测α-SMA及COL-1表达 石蜡切片经脱蜡、水化，抗原修复冷却后，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶的活性，血清封闭，孵育一抗、孵育二抗，DAB显色，苏木素复染、脱水、透明后封片、镜检，观察α-SMA及COL-1表达，并使用ImagePro Plus软件进行半定量分析。

1.2.4 大鼠肝脏总铁含量检测 按照文献 [8]报道，采用火焰原子吸收光谱法测定。

1.3 统计学分析 本实验结果采用SPSS 23.0软件进行数据分析，实验所涉及数据中符合正态分布的计量资料采用均数±标准差(±s)表示，不符合正态分布的计量资料或计数资料采用中位数(M)、四分位数(Q)表示；对于计量资料，符合正态分布且方差齐者，采用One-way ANOVA LSD统计方法处理数据，对于计数资料，采用卡方检验统计分析，最终结果以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血清肝损伤指标检测 与对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST水平显著升高(P＜0.05)，逍遥散全方及各功效拆方组均可显著抑制慢性铁过载诱导的肝细胞损害，阳性对照药与逍遥散全方组结果相仿(P＜0.05)。逍遥散去疏肝药组、逍遥散去健脾药组、逍遥散去养血药组与逍遥散全方组相比，疗效均显著降低(P＜0.05)。见表1。

表1 逍遥散及各功效拆方对慢性铁过载诱导的大鼠肝纤维化肝功能的影响

2.2 大鼠肝脏病理组织学检测 HE染色显示对照组无炎症细胞浸润，肝细胞多，胆管少，肝小叶结构完整，无明显脂肪浸润。模型组可见汇管区大量炎细胞浸润，中央静脉与肝血窦扩张淤血，汇管区纤维组织增生，肝小叶间胆管明显增生，部分分割包绕形成假小叶，Ishak评分较对照组显著升高(P＜0.05)。逍遥散全方及各功效拆方组与模型组比较均有不同程度的改善作用，Ishak评分均有不同程度的降低(P＜0.05)。阳性对照药与逍遥散全方组结果相仿(P＜0.05)。逍遥散去疏肝药组、逍遥散去健脾药组、逍遥散去养血药组与逍遥散全方组相比，疗效均显著降低(P＜0.05)。见图 1、表2。

图1 逍遥散及各功效拆方对慢性铁过载诱导的大鼠肝纤维化病理组织学HE染色的影响（×100）

Masson染色及苦味酸-天狼星红染色可见对照组仅在中央静脉壁和汇管区间有极少量胶原纤维沉积，模型组可见胶原纤维沉积显著增加，增生的小胆管及其周围的胶原纤维形成间隔，部分与临近的增生间隔相互连接、包绕、分割，形成假小叶(P＜0.05)。逍遥散全方及各功效拆方组对胶原纤维增生均有不同程度的明显减轻，纤维间隔变窄，假小叶形成减少(P＜0.05)。阳性对照药与逍遥散全方组结果相仿(P＜0.05)。逍遥散去疏肝药组、逍遥散去健脾药组、逍遥散去养血药组与逍遥散全方组相比，疗效均显著降低(P＜0.05)。见图 2、图 3，表 2。

图2 逍遥散及各功效拆方对慢性铁过载诱导的大鼠肝纤维化病理组织学Masson染色的影响（×100）

图3 逍遥散及各功效拆方对慢性铁过载诱导的大鼠肝纤维化病理组织学苦味酸-天狼星红的影响（×100）

表2 逍遥散及各功效拆方对慢性铁过载诱导的大鼠肝纤维化病理组织学的影响

2.3 大鼠肝脏免疫组织化学检测 对照组仅见极少量α-SMA和COL-1表达，模型组可见在汇管区、纤维间隔区α-SMA和COL-1明显表达(P＜0.05)。逍遥散全方及各功效拆方组α-SMA和COL-1表达均有不同程度的明显降低(P＜0.05)。阳性对照药与逍遥散全方组结果相仿(P＜0.05)。逍遥散去疏肝药组、逍遥散去健脾药组、逍遥散去养血药组与逍遥散全方组相比，疗效均显著降低(P＜0.05)。见图4、图5、表3。

图4 逍遥散及各功效拆方对慢性铁过载诱导的大鼠肝纤维化免疫组化α-SMA表达的影响（×100）

图5 逍遥散及各功效拆方对慢性铁过载诱导的大鼠肝纤维化免疫组化COL-1表达的影响（×100）

表3 逍遥散及各功效拆方对慢性铁过载诱导的大鼠肝纤维化免疫组化的影响

2.4 大鼠铁代谢相关指标检测 与对照组相比，模型组血清铁、铁蛋白及肝脏总铁含量均显著升高(P＜0.05)。逍遥散全方及各功效拆方组血清铁、铁蛋白及肝脏总铁含量均有不同程度的明显降低(P＜0.05)。阳性对照药与逍遥散全方组结果相仿(P＜0.05)。逍遥散去疏肝药组、逍遥散去健脾药组、逍遥散去养血药组与逍遥散全方组相比，疗效均显著降低(P＜0.05)。见表4。

表4 逍遥散及各功效拆方对慢性铁过载诱导的大鼠肝纤维化铁代谢指标的影响

3 讨论

肝纤维化是一种动态可逆性的病理过程，若未采取有效措施进行干预，甚至可进展为肝硬化，严重危害人类的健康。因此，在肝纤维化阶段及早采用药物进行有效干预，是防治肝硬化的重要治疗策略。西医学对肝纤维化、肝硬化迄今没有满意的治疗方法。所以，寻找有效的治疗手段仍是防治肝硬化研究领域的难点及热点。中医学认为肝硬化发病早期病位常常在肝，随着病情的不断恶化与进展，最终使脾肾受累。肝硬化其病理因素一般为气滞、血瘀、水湿，这三者往往互为因果，相互为病，致使疾病错综复杂，因此肝硬化一旦到晚期则殊难治疗，预后较差。综上所述，临床上肝郁脾虚证在乙肝后肝硬化代偿期时较为多见，而针对这一时期进行有效的规范化治疗能够取得较好的效果。

肝脏是体内主要的铁贮存部位，在对机体铁稳态的调节中起着中心和枢纽的作用。铁过载引起的肝损伤在多种急慢性肝损伤疾病或动物模型引起的肝纤维化中均可能出现，如酒精性肝病，非酒精性脂肪性肝炎，CCL4、DMN等毒性药物引起肝纤维化，遗传性血色病，丙型肝炎等[9-14]。有研究发现，乙型肝炎、乙肝后肝硬化患者血清中铁含量、总铁结合力、铁蛋白等指标均较健康人显著升高，且与疾病的严重程度成正相关[15-16]。因此，有理由相信，铁代谢紊乱在肝纤维化、肝硬化发生发展中起着十分重要的作用。

中医学未有对铁的直接描述，而可以认为铁是体内的水谷精微物质之一，而精微物质的转运离不开脾之运化功能及肝之疏泄功能的正常发挥。正如罗梅宏等[17-18]发现脾运无力在缺铁性贫血的发病过程中的具有重要作用，通过临床与实验皆证实了通过运脾法能够显著调节机体的铁代谢平衡。因此可以理解为中焦脾胃在精微物质铁的吸收转运及最终参与生成血液的过程中有着十分重要的作用，故而有“脾胃是气血生化之源”之说。而肝脏主疏泄而藏血，在血液形成过程中亦有举足轻重的作用。水谷精微源于脾胃，脾胃纳化水谷，输布精微，赖肝气为之疏泄。故《血证论》说：“食气入胃，全赖肝木之气以疏泄之而水谷乃化。”因此，铁代谢紊乱反映的是肝失疏泄和脾运失常。临床上肝纤维化或肝硬化患者常常存在肝失疏泄和脾运无权等情况，以致不能将铁转运至血液循环中为造血器官所利用，引起贫血，并沉积于肝脏等器官，引起纤维化的发生，故在治疗上应着眼于疏肝健脾。

逍遥散是中医学疏肝健脾的经典名方，在临床上广泛应用于慢性肝炎、肝硬化、胆石症、胃及十二指肠溃疡、慢性胃炎、胃肠神经官能症、经前期紧张症、乳腺小叶增生。课题组前期通过对逍遥散联合恩替卡韦治疗肝郁脾虚型乙肝后肝硬化代偿期患者的随机对照研究中发现，逍遥散具有显著的改善纤维化作用，并能够改善患者机体的铁过载水平[19]。基于此我们提出了指导进一步研究的假说：逍遥散通过疏肝健脾之法调节机体铁转运，又通过其养血之能，促进铁利用。总而言之，其疏肝、健脾、养血之功效均参与了对机体铁稳态的调节进而发挥抗肝纤维化的作用。为此我们开展了实验验证工作，结果表明，逍遥散能显著改善慢性铁过载诱导的大鼠肝纤维化，主要表现在降低血清ALT、AST水平，改善纤维化病理表现及抑制肝星状细胞活化指标如α-SMA和COL-1表达。而逍遥散的这些作用也已在其他肝纤维化模型中所证实[20-21]。而我们进一步检测了各组大鼠血清中铁及铁蛋白含量及肝脏总铁含量的变化，发现逍遥散可显著减大鼠体内铁过载水平。随后我们又通过功效拆方，将逍遥散全方中疏肝药(柴胡、薄荷)、健脾药(茯苓、白术、甘草、生姜)、养血药(当归、白芍)进行拆解研究，结果表明逍遥散去疏肝药组、逍遥散去健脾药组、逍遥散去养血药组与逍遥散全方组在改善肝细胞损伤、纤维化及铁过载方面均有显著差异，提示整方无论去除疏肝药、健脾药或养血药均对整方疗效有显著影响，换而言之，逍遥散中疏肝、健脾、养血之功效都参与了机体铁稳态的调节进而发挥了抗肝纤维化的作用。

综上所述，中药复方逍遥散是临床上疏肝健脾的代表方剂，其疏肝、健脾、养血功效均与维持机体铁稳态相关，因此有理由相信，其能够重塑肝脏铁稳态进而发挥其抗纤维化作用，但具体调控铁代谢的机制仍需进一步研究。本课题的设计完成，不仅对完善中医学铁代谢的理论认知起到促进作用，更关键的是对传统方药逍遥散的组方功效进行了创新性的解释，为逍遥散调节机体铁稳态提供了理论及实验基础，为中药复方研究的快速发展提供了新的思路。