王一波，祝 山，郭文通，秦虎强，刘 巍，徐亮胜，黄丽丽

(西北农林科技大学 植物保护学院，陕西杨凌 712100)

猕猴桃是一种重要的经济作物，凭借其风味独特、维生素C含量高、营养价值丰富，已经成为很多地区脱贫致富的支柱产业[1]。但是，由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的猕猴桃细菌性溃疡病是制约猕猴桃产业发展的重大病害，已造成严重的经济损失[2]。该病害发展迅速、危害严重、防治困难，已在亚、欧、澳、南美洲等地的主要猕猴桃产区广泛流行，成为备受关注的世界性病害。猕猴桃细菌性溃疡病在中国主要分布于陕西、四川、河南、贵州、浙江等省[3]。

随着分子生物学技术的发展，国内已建立多种基于PCR原理的Psa分子检测方法。例如，Yao等[4]建立的四川省Psa病原菌特异性检测方法；谢锦添等[5]建立的Psa实时荧光定量PCR检测方法等。但这些检测方法由于依赖价格昂贵的检测设备，专业的检测步骤，使其广泛应用受到限制。因此，生产中亟需一种灵敏度、特异性、稳定性能与PCR检测相当，且不受实验设备限制的检测方法。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是在2000年由Notomi等[6]建立的一种等温扩增技术。凭借其特异性强、灵敏度高、操作简单、检测成本低等优点，LAMP检测技术被广泛应用于各个领域，逐渐成为可以替代传统PCR检测的新检测技术。LAMP反应过程依赖于靶标DNA6个独立的区域，因而其特异性非常高。同时，LAMP反应在等温条件下进行，使用能够维持稳定恒温的设备(水浴锅、保温桶等)即可完成，而不需要PCR仪等昂贵设备，从而使检测成本大幅降低，应用范围显著扩大；另外，检测结果可通过加入多种染料呈现出可视化[7]。

Ruinelli等[8]已经针对Psa全球主要流行变种(Psa3)，同时也是中国主要流行种，设计了特异性LAMP检测方法，但其检测主要采用试剂盒，检测结果判断依赖荧光定量PCR仪观察扩增曲线，并没有发挥LAMP检测技术操作简便、检测成本低等优点。本研究旨在通过测试并优化该LAMP反应体系、简化检测步骤、加入荧光染料SYBR green I等手段，来降低反应成本，减少操作步骤，建立一种便捷、可视化的LAMP快速检测体系。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 试验所使用的5株猕猴桃细菌性溃疡病病原菌标准菌株、5株外源对照菌株均由西北农林科技大学果树病害病原生物学及综合防治研究团队实验室分离并保存。

1.1.2 主要试剂及仪器 试剂：LB培养基；Bst 2.0 DNA聚合酶，购自NEB公司。dNTP混合液、甜菜碱，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Eva Green，购自biotium公司；5×等温扩增缓冲buffer[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，250 mmol/L KCl，50 mmol/L(NH4)2SO4，0.5% Tween-20)]。

仪器：荧光定量PCR仪(LC-96)购，购自Roche公司；PCR仪，购自thermoFisher公司；引物：参考Ruinelli等[8]的方法，所设计引物针对Psa 3，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 LAMP方法所用引物Table 1 Primer,sequence and length of LAMP

1.2 方 法

1.2.1 标准及对照菌株菌悬液制备 取-80 ℃低温保存的各个菌液，于LB平板上划线培养， 25 ℃活化48 h，挑取单菌落，于液体LB培养基中 25 ℃摇培14 h。取100 μL菌悬液置于1.5 mL离心管中，将其于沸水中煮沸15 min，作为DNA模板，备用。

1.2.2 LAMP反应体系优化 针对LAMP反应主要影响因素，设置浓度梯度(Mg2+浓度0、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L、6 mmol/L、7 mmol/L；甜菜碱浓度0、0.5 mol/L、1 mol/L、1.5 mol/L、2 mol/L)，检测单一变量下，反应体系的最优反应浓度；设置6个反应温度(60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、 65 ℃)，反应体系中加入Eva Green定量监测反应进程，测试在不同甜菜碱浓度下反应最适浓度、不同温度下反应最适温度及时间；选择最优反应体系、最适反应温度和最短时间。以标准菌株M228为阳性对照，灭菌水为阴性对照。

1.2.3 LAMP特异性测试 利用建立好的LAMP检测体系，在最适温度下，用不同菌种的DNA模板进行LAMP扩增，以灭菌水为阴性 对照。

1.2.4 LAMP灵敏性测试 通过分光光度计测定M228菌悬液的OD600值，用无菌水将菌悬液浓度调到OD600=0.1(108CFU/mL)。然后，将菌悬液浓度调到106CFU/mL，之后按10倍梯度稀释7个浓度梯度。利用已建立的LAMP体系进行灵敏性测试，每个浓度重复3次，无菌水为阴性对照。

1.2.5 田间样品LAMP检测 分别于陕西眉县、周至县和杨凌区等地，在猕猴桃果园采集树皮、根、叶片、果柄组织样品共122份，其中树皮样品45份、根样品14份、叶片样品36份、果柄样品12份、花样品15份。经清水冲洗和75%酒精表面消毒后，用灭菌的手术刀切下1 cm长宽的植物组织，切碎并放置于1.5 mL离心管中，加入 1 mL无菌水，静置10 min后，100℃水浴10 min，以悬浮液为模板，进行LAMP检测。

2 结果与分析

2.1 LAMP反应体系优化结果

研究结果表明，猕猴桃细菌性溃疡病LAMP检测方法最适Mg2+浓度为2 mmol/L(图1)；最适甜菜碱浓度为1.5 mol/L(图2-A)；最终确定25 μL反应体系为：8 U Bst 2.0 DNA聚合酶，5 μL 5×等温扩增缓冲Buffer，2 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，1.5 mol/L甜菜碱,1.6 μL FIP和BIP,0.2 μL F3和B3，0.4 μL LoopF和LoopB(引物初始浓度为10 μmol/L)，1 μL模板DNA。其反应的最适温度为65 ℃，并在反应约 25 min后达到平台期，所以确定反应时间为30 min。

2.2 LAMP特异性检测

于最适温度下测试的特异性检测结果显示(图3)：只有5株Psa菌株有明显的阳性结果，而其他5株对照菌株及阴性对照均无颜色变化，表明建立的LAMP检测方法具有良好的特异性。

2.3 LAMP灵敏性检测

于最适温度下测试的灵敏性检测结果显示(图4)：LAMP检测结果在菌悬液浓度分别为106、105、104、103、102CFU/mL时均可得到阳性检测结果，因此LAMP检测方法最低可以检测到102CFU/mL的标准菌株菌悬液浓度。

2.4 田间样品LAMP检测

田间样品检测结果显示(表2)，花样品共采集并检测15份，其中12份为阳性结果，带菌率为 66.7%；叶片样品共采集并检测36份，其中23份为阳性结果，带菌率为63.0%；果柄样品共采集并检测12份样品，其中3份为阳性结果，带菌率为25.0%；树皮样品共采集并检测45份，其中35份为阳性结果，带菌率为77.0%；根样品共采集并检测14份样品，其中5份为阳性结果，带菌率为35.7%。

表2 田间样品检测结果Table 2 Source,quantity,infected rate of field samples

3 讨 论

由于猕猴桃细菌性溃疡病具有扩展快、危害重、防治难等特点，所以病原菌的早期诊断对病害的精准防治尤为关键。因此，开发一种针对其病原菌的快速、准确的检测方法为病害侵染早期有效识别和及时防治至关重要。

相比于PCR检测或qRT-PCR，LAMP检测具有明显优势，主要体现在：①特异性强，即反应所需的内外两对引物基于目的基因的6个位点设计，检测过程中必须与引物完全匹配才能扩增；②灵敏度高，即该检测方法灵敏度一般比PCR低10倍[9]，但通过引物筛选，反应体系优化等步骤可将检测灵敏度提高。Duan等[10]在核盘菌高抗苯并咪唑菌株LAMP检测方法的研究中，通过体系优化，LAMP灵敏性比PCR高1 000倍；③设备简单，即不需要专业的PCR仪及电泳设备，因为LAMP反应是恒温扩增，通过简单的水浴锅或保温杯等恒温设备即可实现扩增；④反应时间短，即LAMP反应通常1 h内可完成，本研究优化后的反应体系可于30 min内完成反应，相比于PCR长时间的反应过程及后续电泳结果判定，LAMP具有明显的优势；⑤反应结果可视化，即在理论上，LAMP检测结果可通过观察反应扩增副产物焦磷酸镁(白色沉淀)[11]直接判定结果。但通常情况下，并不会很容易观察沉淀，所以可通过加入SYBR Green I[12]或者羟基萘酚蓝(HNB)[6]等染料来使反应结果呈现出可视化。

本研究参考国外猕猴桃细菌性溃疡病LAMP快速检测方法，并在其基础上进行一定优化。首先是降低成本，通过建立并优化反应体系，抛弃对试剂盒的依赖，降低检测成本。然后通过使检测结果的可视化，使检测的结果判定不依赖于专业仪器，并且可以在反应完成后直接观察检测结果，从而提高检测效率。同时，检测的灵敏性达到102CFU/mL，完全可以用于田间检测。

田间检测结果揭示猕猴桃不同的组织部位均可带菌，且带菌率较高，其中树皮中带菌率高达77.0%。此结果提示：在田间防治猕猴桃溃疡病时要全面喷防药剂，同时要重点关注幼枝树皮、叶片和花等部位的防治。

猕猴桃细菌性溃疡病严重威胁猕猴桃果树的健康，阻碍中国猕猴桃产业的发展。本研究结合以往国外猕猴桃检测方法建立的经验，通过对反应体系的优化、反应结果的可视化使LAMP检测方法能够得到更广泛的应用，本研究结果无论对猕猴桃的引种栽培还是猕猴桃细菌性溃疡病的季节性精准防治都具有借鉴作用。