方改霞，耿璐璐，黄金绒，侯凯玉，洪 军，李冰冰

(1.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036;2.河南省健康食品工程技术研究中心，河南 平顶山 467036)

霉菌在食品、农产品及食用菌栽培基质等方面均有较大危害。常见的主要有黑曲霉(Aspergillusnige)、黑根霉(Rhizopusnigricans)、绿色木霉(Trichodermaviride)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)以及黄曲霉(Aspergillusflavus)等。目前针对霉菌的防治多采用化学消毒剂，但往往会污染环境及影响人体健康，这一问题已引起了全球性关注。为避免化学物质的影响，一些植物的天然产物已被证明是好的真菌抑制物[1-2]。丁香、花椒、黄芩等中药材提取物对多种真菌具有明显抑制作用[3-6]；土荆皮含有多种抗真菌的有效成分，并且可以与中药和西药联合制成复方制剂，增强其抑菌作用[7]。Muswar Ali Gadhi等[8]发现植物(芝麻、椰子、指甲花、薄荷、黑籽等)精油也能有效抑制由链格孢菌引起的鹰嘴豆出现的叶枯病，并可用于生物防治。豆康宁等[9]把甘草粉及其甘草黄酮成分作用于面包，起到了防腐效果等。而若对单味中药进行合理的配伍组合成复方药，利用复配中多味理化性质不同的中药成分之间的相互作用，从而改变复方药物的整体活性或毒性[10]，通常能提高药效，降低药物毒性[11-15]。因此以单味中草药进行配伍来寻找新的抗霉菌药物是一个可行的途径。

本研究以5株霉菌为指示菌，测定丁香、土荆皮、花椒、黄连、甘草等21种单味中草药醇提物的抗霉菌效果，并研究了不同中草药配伍后对霉菌协同抑制效果，以期为开发天然绿色的新型抗霉菌药物提供科学依据。

1 材料及方法

1.1 实验材料

菌种：绿色木霉CICC13015、黑根霉(M.racemosus，3.413)、黑曲霉BNCC340101、桔青霉ATCC1109以及黄曲霉AS3.39505均由河南省健康食品工程技术研究中心提供。

中草药：丁香、花椒、黄柏、金银花、黄连、大青叶、野菊花、连翘、蒲公英、甘草、大黄、高良姜、桔皮、石榴皮、土荆皮、蛇床子、千里光、川楝子、合欢皮、柠檬皮等均购自河南省平顶山市张仲景大药房；桉叶购自淘宝网店方士居。

1.2 主要试剂

PD培养基、PDA培养基、0.5%多菌灵、生理盐水以及无水乙醇等，均由平顶山市伟业物资经营公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化与菌悬液制备

将二代斜面霉菌菌种接种至PD液体培养基，150 r/min，于25 ℃培养2～3 d后取菌悬液画线于PDA斜面培养基上，28 ℃培养2～3 d后用无菌生理盐水冲洗，并用8层纱布过滤除去菌丝体，用血球计数板对霉菌孢子悬液计数后，将浓度调整为105cfu/mL，用于抑菌实验[16]。

1.3.2 中草药有效成分的提取

采用索氏醇提法提取中草药[17]。称取50 g粉碎后过40目筛网的中草药粉末装入滤纸桶中，将滤纸桶放入索氏提取器萃取室内，当萃取室内药液颜色变浅或无色时，即萃取完成。再用旋转蒸发仪将药液浓缩至50 mL，制得原液，其生药浓度为1 g/mL。文中浓度均为生药浓度。

1.3.3 中草药提取液抑菌圈测定

采用牛津杯法[18]测定抑菌圈直径，接药量为100 μL/杯。实验平板培养72 h。

抑菌效果判定标准[19]：抑菌圈直径>15 mm表明，该微生物对抑菌剂高度敏感；11～15 mm为中度敏感，6～10 mm为低度敏感，而6 mm为不敏感。

1.3.4 数据处理及SPSS 21分析

数据均为3组数据的平均值±标准差；用SPSS 21软件对抑菌效果较好的单剂及复合剂进行单因素方差分析，若P>0.05，无显著性差异；P<0.05，有显著性差异；若P<0.01，呈极显著差异。

1.3.5 共毒系数法

共毒系数CTC=(混剂实测毒性指数ATI/混剂理论毒性指数TTI)×100%

其中：混剂实测毒性指数ATI∝混剂抑菌圈直径；混剂理论毒性指数TTI∝A药剂抑菌圈直径×混剂中A药剂百分含量+B药剂抑菌圈直径×混剂中B药剂百分含量；共毒系数CTC>1.2为协同作用，CTC<0.8为拮抗作用，0.8

2 结果与分析

2.1 单剂中草药的筛选结果及分析

将21种中草药提取物分别与黑曲霉、黑根霉、绿色木霉、黄曲霉和桔青霉作用72 h(作用时间，下同),发现丁香、黄连、土荆皮、花椒、甘草等对一定的霉菌抑菌效果较好，详见表1和表2。效果较差的未一一列出。

表1 单剂提取液对霉菌的抑菌圈测定 (抑菌圈直径/mm)

续表1

丁香对5种霉菌均有明显的抑菌效果，在0.2～1.0 g/mL范围内仅对绿色木霉的作用有显著性差异，其最佳抑菌浓度为0.4 g/mL。结合其差异性分析及对霉菌的抑制效果选出5个浓度：0.4 g/mL、0.5 g/mL、0.6 g/mL、0.7 g/mL、0.9 g/mL；土荆皮对黑曲霉、黑根霉、黄曲霉和桔青霉均有明显的抑菌效果，但不同浓度之间均无显著性差异，同理选出5个浓度：0.3 g/mL、0.4 g/mL、0.7 g/mL、0.9 g/mL、1.0 g/mL；花椒对黑根霉有明显的抑菌效果，但各浓度间无显著性差异，故选出3个浓度：0.3 g/mL、0.7 g/mL、1.0 g/mL；甘草对黑根霉和绿色木霉均有明显的抑菌效果，且对绿色木霉有显著性差异，其最佳抑菌浓度为0.8 g/mL和1.0 g/mL，再结合经济性原则选出3个浓度：0.4 g/mL、0.8 g/mL、1.0 g/mL；黄连对绿色木霉有明显的抑菌效果且具有显著性差异，其最佳抑菌浓度为0.7 g/mL和0.9 g/mL，同理选出了3个最佳浓度：0.5 g/mL、0.7 g/mL以及0.9 g/mL。

据上，最终确定以丁香、黄连、土荆皮、花椒及甘草5种中草药及相应浓度进行后续组合配伍实验。

2.2 二种中草药配伍复合剂的筛选结果及分析

对所挑选的单剂中草药进行二种组合，共得142种组合；分别对5种霉菌进行抑菌实验，从中挑选出抑菌效果较好的20种组合，结果见表2。

表2 二种中草药提取液配伍复合剂对霉菌的抑菌结果

续表2

丁香/土荆皮组合、丁香/黄连组合、丁香/花椒组合、土荆皮/黄连组合、土荆皮/甘草组合和土荆皮/花椒组合在相应浓度下对5种实验霉菌均有明显的抑菌效果，且对各菌株具显著性差异(P<0.05)；丁香/甘草组合则对实验霉菌有明显的抑菌效果，但对各菌株不具有显著性差异(P>0.05)；甘草/黄连组合、甘草/花椒组合、花椒/黄连组合对黑曲霉、黄曲霉、桔青霉的抑菌效果较弱，不再作为进一步筛选对象。

2.3 三种中草药配伍复合剂的筛选结果及分析

为避免药与药之间的配伍拮抗作用，对所得三种中草药的36种配伍组合再进行抑菌效果实验，得到11种抑菌效果较好的三种中草药配伍复合剂，结果见表3。表3中丁香/土荆皮/花椒、丁香/土荆皮/黄连在对应浓度下对5种霉菌的抑菌效果具有显著性差异，其他组合则无。土荆皮/黄连/花椒组合、土荆皮/花椒/甘草组合、土荆皮/黄连/甘草组合对4种实验霉菌的杀菌效果不及某些两种中草药配伍组合，故筛除。

表3 三种中草药提取液配伍复合剂对霉菌的抑菌结果

2.4 四种中草药配伍复合剂的筛选结果及分析

同上节所述，选择性配伍四种中草药复合并进行抑菌实验，共9种组合，其结果见图1。

注：中草药组合各组间标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。图1 四种中草药提取液配伍复合剂对霉菌的抑菌结果

表4中丁香/土荆皮/花椒/黄连组合、丁香/土荆皮/花椒/甘草组合在对应浓度下对5种霉菌均具有显著性差异(P<0.05)，其中⑤和⑥这两种组合抑菌效果极显著(P<0.01)。同时对四种中草药配伍复合剂进行共毒系数分析，发现这9种由四种中草药的组合剂均呈现出协同(CTC>1.2)或累加作用(0.81.2)。综上分析，⑤和⑥这两种组合剂不但抑菌效果较好，而且各药成分间呈协同作用。

表4 四种中草药提取液配伍复合剂对霉菌的共毒系数

2.5 五种中草药配伍复合剂的抑菌及筛选结果

对表4选出的四种中草药配伍复合剂进行选择性配伍，得到6种五种中草药配伍组合。与图1相比，图2显示五种中草药配伍复合剂抑菌效果远不如其他组合复合剂，且该复合剂所涉及中草药较多，经济效益不明显，故该组合不作为最终复合剂的筛选对象。

2.6 最终目标制剂的选定

分别对表5中抑菌效果较佳的二种、三种和四种中草药配伍复合剂进行抑菌效果显著性分析，发现复合剂5和复合剂6对5种霉菌的抑菌效果突出，进一步做SPSS单因素方差分析，结果见表6。

表6 中草药复合剂5和复合剂6单因素方差分析

据表6可知，该组合对各污染霉菌的抑制效果不具有显著性。因此中草药复合剂5和6属于广谱杀菌剂，故最终确定C丁香C土荆皮C花椒C黄连=0.9 g/mL0.4 g/mL0.7 g/mL0.5 g/mL和C丁香C土荆皮C花椒C甘草=0.4 g/mL0.9 g/mL0.3 g/mL0.4 g/mL作为目标中草药复方剂。

3 结论与讨论

3.1 结论

综合中草药乙醇提取物的单剂和复合剂的抑菌效果及经济成本，最终配伍筛选出了含有丁香、土荆皮、花椒以及黄连或甘草等乙醇提取物组成的2种抑制霉菌效果较佳的中草药复方剂。

3.2 讨论

本试验首先利用21种中草药乙醇提取物分别作用于黑曲霉、黑根霉、绿色木霉、黄曲霉和桔青霉，发现土荆皮抑菌效果明显，这与付雯[20]等选用12种中草药作用于桔青霉时所得结果一致，同时发现土荆皮浸提物在抑菌过程中，若喷洒频率合适，其效果可能会高于化学杀菌剂，故本试验后期可进一步探究对中草药的作用时间；同时本试验还发现，丁香、花椒、甘草及黄连等中草药醇提物也有较好地抑菌效果。

目前临床上常采用联合用药治疗真菌耐药问题，其理论基础是不同药物抑制微生物代谢的不同阶段或不同靶位而产生协同作用；经共毒系数法复证，在所选20种二种配伍、11种三种配伍中，其抑菌效果与同浓度单剂相比，大多表现为协同或累加，少数为拮抗，且拮抗是与个别霉菌作用时的效果，而所选的9种四种配伍与同浓度单剂相比均表现为协同或累加，其中配伍复合剂5、6的药效均为较强协同作用，但由于筛选配伍时首先关注的是抑菌效果，其次才关注药物间的相互作用，故效果最佳的配伍复合剂可能未被选出。本实验还发现二种配伍土荆皮与花椒联合作用于绿色木霉时有明显抑菌作用，而单剂土荆皮、花椒则对绿色木霉无明显抑菌效果，该原因值得进一步探究。王柱华[21]发现黄连乙醇提取物对白色念珠菌具有显著地抑菌效果，在一定浓度范围内,黄连提取物的抗真菌作用随药液浓度的增大而增强,呈剂量依赖性，并且黄连和黄芩这两种药物对白色念珠菌的抑制作用效果最好。周学东等[22]发现丁香提取液对黑曲霉、扩展青霉也有很好地抑制作用，这提示该试验研制的配方可能对白色念珠菌和扩展青霉也有一定的抑制效果，这有待进一步验证。

中草药成分复杂，粗提物中抗菌有效成分不太明确，含量也相对较少，所以应进一步深入探究这两种中草药制剂中的抗真菌作用的单体活性成分，以及提取方法等条件的优化，力求发掘新的抗霉菌药物。