李文建，王 澎，王观龙，谢朝晖，朱 涛，王莲哲

(河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036)

花青素(anthocyan)又称花色素或花色苷，是一类水溶性的类黄酮类化合物。作为天然色素，其广泛存在于植物营养器官和繁殖器官中，使组织器官呈现出红、蓝、紫等颜色，同时也有利于提高植株繁殖后代和抵御不良环境等方面的能力[1]。植物类黄酮物质合成途径中的第一个关键酶，即查尔酮合酶(chalcone synthase，CHS)，由催化香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A反应而生成查尔酮[2]。近年来，酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等真核表达系统相继发展和完善，然而应用最多、最广泛的仍是大肠杆菌原核表达系统[3]。原核表达系统生产重组蛋白具有周期短、产量高、可重复性好、操作简便等优点[4]。

1 材料与方法

本文将建兰花色形成关键基因的编码区片段定向克隆至pET28a质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导，SDS-PAGE检测表达产物蛋白特征，并优化该蛋白的最佳诱导表达条件。

1.1 实验材料

建兰花瓣材料均源于同一植株，以此保证所有花瓣组织基因组遗传背景的一致性，从而减轻建兰基因组序列源头差异给关键基因克隆与表达研究带来的误差。

1.2 培养基

(1)LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，NaCl 5 g/L，NaOH溶液调pH值为7.0；

(2)LB固体培养基：在(1)基础上加入15 g/L琼脂粉。

1.3 引物

用Primer Premier5.0软件设计引物，分析pET28a载体多克隆位点区域，分别加入酶切位点。

CeCHS1-S：5′-CGGAATTC(EcoRI)ATGGCGCCGGCGTTGGAAGC-3′

CeCHS1-A：5′-CGCTCGAG(XhoI)TCACTCCGCATTAGCAATCG-3′

根据建兰植株18S序列设计RT-PCR验证引物：

18s-113-s:5′-CAACCATAAACGATGCCGACC-3′

18s-113-a:3′-CCCTCATACCAGCGTTCCGAC-5′

1.4 建兰花瓣总RNA提取

取建兰同一植株完全开放花，无水乙醇擦拭洁净花瓣，解剖刀裁取花瓣两种颜色部位组织混合。……