王春花，曲雪嘉，孔令钰，孙雪芳

（牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157000）

菊花为菊科植物菊（Chrysanthemum morifoliumRa-mat.）的干燥头状花序，属于药食同源类中药，其药用最早记载于《神农本草经》，属上品，归肺、肝经，久服轻身耐老延年，具有清热解毒、平肝明目等功效，在临床上常被用于治疗风热感冒、目赤肿痛、疮痈肿毒等症［1，2］。在日常生活中，老百姓也常茶饮菊花或配伍其他中药达到清热解毒、防治疾病的作用。现代药理学研究表明，菊花具有抗炎、抑菌、调节免疫、镇痛等作用，其清热解毒功效与菊花抗炎药理活性有一定的相关性［3］。目前，有关菊花的研究多集中在单一化学成分及其药理作用的解析，中医理论指导下的清热解毒功效的物质基础及分子作用机制方面的研究相对匮乏［3-5］。系统药理学是从多成分-多靶点相互联系的角度在整体水平上研究中药作用机制的一种新手段，通过识别药效物质、药物靶点揭示疾病治疗机制，从系统水平及整体水平研究和解决中药药效学和中医药基础理论等关键问题，其研究方法符合中药治疗疾病的核心思想。近年来，在探索和预测中医药治疗不同疾病的分子机制方面做出了显著贡献［6-8］。本研究采用系统药理学方法，探讨了菊花清热解毒功效的分子机制，为菊花清热解毒功效的研究与应用提供理论基础与科学依据。

1 材料与方法

1.1 菊花活性化合物-靶点网络的构建

借助中药系统药理学分析平台TCMSP（http：//tcmspw.com/index.php）检索并筛选菊花中符合口服利用度利用TCMSP、Drugbank数据库（https：//www.drugbank.ca）搜索化学成分的靶标蛋白质，合并作为化学成分的靶点。将化合物-靶点通过Cytoscape 3.7.1软件构建菊花化合物-靶点网络，分析化合物和靶点间的度（Degree）值，确定菊花关键靶点。

1.2 菊花靶点GO富集及关键靶点KEGG通路富集分析

将菊花靶点蛋白质基因上传在线数据库DAVID（https：//david.ncifcrf.gov），物种限定为“Homospaiens”，设定阈值P＜0.05，进行GO（Gene ontology）生物学过程富集分析。对菊花靶点蛋白质进行KEGG（KEGG pathway analysis）代谢通路富集分析，并通过Cyto⁃scape 3.7.1软件构建靶点-信号通路网络，分析菊花清热解毒功效的分子机制。

1.3 菊花靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将菊花相关靶点带入在线网站STRING 11.0（https：//string-db.org），物种选择为“Homo spaiens”，打分值设置＞0.9，获取菊花化合物靶点PPI网络信息，删去无关联蛋白质，通过Cytoscape 3.7.1软件构建菊花靶点PPI网络，分析菊花清热解毒功效靶点相互作用关系。

1.4 菊花靶点器官定位

通 过BIOGPS数据库（http：//biogps.org/#goto=welcome）对核心靶点进行器官定位分析，统计并整理各靶点组织分布信息，通过Cytoscape 3.7.1软件绘制菊花核心靶点-组织网络。

2 结果与分析

2.1 菊花化合物-靶点相互作用网络

利用TCMSP平台筛选并去除无靶点化合物后共获得21种符合条件的活性成分。如图1所示，化合物-靶点网络共包括276个节点（21种化合物、255个靶点）和561条边，菊花化合物由红色节点代表，节点大小与Degree值相关，蓝色节点代表靶点，内圈蓝色节点为连接化合物大于10个的靶点，该网络说明菊花清热解毒功效可能是多成分、多靶点作用的结果。在菊花化合物-靶点网络中，每个化合物有平均靶点数目26.7个，每个靶点平均与12.1个化合物相互作用，Degree值排名前5的成分是槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteo⁃lin）、柚皮素（Naringenin）、β-谷甾醇（Beta-sitoster⁃ol），靶点≥10的化合物为菊花关键成分（表1）。从靶点的角度来看，连接化合物≥10个的靶点有6个，分别为前列腺素G/H合酶2（Prostaglandin G/H syn⁃thase 2）、核受体辅活化子2（Nuclear receptor coacti⁃vator 2）、前列腺素G/H合酶1（Prostaglandin G/H syn⁃thase 1）、热 休 克 蛋 白90（Heat shock protein HSP 90）、二肽基肽酶IV（Dipeptidyl peptidase IV）、cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位α（PKA Catalytic Sub⁃unit C-alpha），连接化合物≥10个的靶点为菊花关键靶点（表2）。化合物-关键靶点-疾病网络如图2所示，菊花关键靶点主要与坏死（Necrosis）、产前暴露迟发效应（Prenatal exposure delayed effects）、化学药物性肝损伤（Chemical and drug induced liver injury）、炎症（Inflammation）、减重（Weight loss）、细胞增生（Hyperplasia）、肾脏疾病（Kidney diseases）和水肿（Edema）相关，推测菊花的清热解毒功效可能与大部分活性成分发挥调控炎症、坏死过程有关。

图1 菊花化合物-靶点网络

表1 菊花度值≥10的活性化合物基本信息

表2 菊花度值≥10的靶点基本信息

2.2 靶点通路分析

图2 菊花化合物-关键靶点-疾病网络

通过DAVID数据库中GO功能富集分析得到GO条目146个（P＜0.05），其中生物过程（BP）条目105个，占72%，分子功能（CC）条目17个，占12%，细胞组成（MF）相关条目24个，占16%，主要GO条目如图3所示。KEGG通路注释分析，按P值排列前15条生物通路结果如图4所示。其中包括癌症信号通 路（Pathways in cancer、Bladder cancer、Pancreatc cancer、Prostate cancer、Non-small cell lung cancer）、炎症信号通路（TNF signaling pathway）、免疫相关信号 通 路（Influenza A、Hepatitis B、Toxoplasmosis、Leishmaniasis、HTLV-Iinfection），通路中出现次数≥10的靶点有12个，包括AKT1、TP53、CCND、TGFB1、CDKN1A、MAPK3、MAPK1、IKBKB、NFKBIA、CHUK、RAF1、BAD，这些靶点蛋白主要参与细胞增殖和生长、细胞凋亡、炎症反应、免疫和应激应答等过程。结果表明，菊花清热解毒的功效与调控这些信号通路发挥抗炎、免疫调节作用有关。

图3 菊花靶点GO富集

图4 菊花靶点KEGG通路

2.3 菊花靶点PPI网络构建与分析

为了更好地理解菊花清热解毒功效的作用机制，利用STRING数据库构建了菊花PPI网络，结果表明，PPI网络包括244个节点，946条相互关系，去掉无相互关系的35个节点，其余209个节点利用Cytoscape 3.7.1软件绘制菊花靶点PPI网络如图5所示。节点Degree值≥10的节点共72个，为菊花的核心靶点，其中JUN、TP53、AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、TNF、HSP90AA1、IL6等出现频率较高，根据Degree值大小绘制Degree值≥20的核心蛋白质节点的条形图（图6）。核心靶点中共包含11个炎症相关靶点（TNF、IL1B、IL6、NOS2、CCL2、CXCL8、IL10、AKT1、VEGFA、MMP9、CXCL2），这些靶点蛋白在菊花清热解毒功效中起到关键作用。

图5 菊花靶点PPI网络

2.4 靶点定位分析与归经理论的相关性分析

图6 菊花核心靶点（Degree值≥20）

利用BIOGPS数据库对主要靶点（Degree值≥20）定位分析，保留每个基因表达量最高的排在前5位的组织，利用Cytoscape软件绘制靶点-组织网络图（图7），图中节点大小与Degree值一致。结果表明，这些靶点主要分布在肺（Lung，Degree值=6），平滑肌（Smooth muscle，Degree值=4），肝脏（Liver，De⁃gree值=3），扁桃体（Amygdala，Degree值=3），甲状腺（Thyroid，Degree值=3），前列腺（Prostate，Degree值=3），该结果与菊花归肺、肝经一致，这些组织器官在菊花清热解毒功效中发挥重要作用。此外，CD33+髓样细胞（CD33+Myeloid，Degree值=9），伯基特淋巴瘤（Lymphoma burkitts，Degree值=6）、心肌细胞（Cardiacmyocytes，Degree值=5）（CD56+NK Cells，Degree值=4）BDCA4+树突状细胞（BDCA4+Dentrit⁃ic Cells，Degree值=4），CD14+单 核 细 胞（CD14+Monocytes，Degree值=4），721 B淋巴母细胞（721 B lymphoblasts，Degree值=4）等细胞发挥重要的作用。

图7 菊花靶点-归经网络

3 讨论

利用系统药理学分析了菊花清热解毒功效的分子机制，以口服生物利用度（OB）与类药性（DL）为指标通过TCMSP与Drugbank数据库筛选出菊花中符合条件的化合物，建立备选化合物库。结果表明，菊花主要通过槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇等化合物发挥清热解毒作用。现代药理学研究表明，菊花中作用最强的前5个化合物在抗炎、抗菌中起到不同程度的作用。槲皮素能明显抑制大鼠急慢性前列腺炎模型与急性痛风性关节炎模型炎症［9，10］，具有广谱抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、胶质芽孢杆菌、大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌均有明显的抗菌效果［11］。山奈酚可通过MAPK等信号通路减轻脂多糖诱导的急性肺炎［12］，抑制气道炎症［13］。木犀草素能够降低炎症因子转录调节因子的活性，抑制IL6等各类促炎因子和炎症介质的产生，改善气道炎症［14］。β-谷甾醇可以抑制肺炎链球菌溶菌素对细胞侵染，通过抑制STAT1的产生及NF-κB的核转移发挥抗炎作用［15］。柚皮素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有较好的抑菌作用［16，17］，可通过抑制炎症细胞浸润、炎症介质释放、iNOS活性等发挥抗炎作用［18，19］。通过化合物-关键靶点-疾病网络分析发现菊花关键靶点主要与炎症、坏死等疾病相关，如菊花关键靶点前列腺素G/H合酶2为体温调节介质前列腺素合成的关键酶，可通过干预前列腺素E2的合成，参与机体发热与炎症等的调节［20］。以上分析说明，菊花的清热解毒功效与其成分槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇等化合物等干预炎症、坏死过程，发挥抗炎抗菌作用有关。

KEGG通路分析结果显示，菊花靶点主要作用于炎症信号通路（TNF signaling pathway）和免疫相关信号通路（Influenza A、Hepatitis B、Toxoplasmosis、Leishmaniasis、HTLV-I infection），其中靶点AKT1、TP53、MAPK3、MAPK1等在通路中出现次数较高，在PPI网络中发现这些靶点为菊花作用的核心蛋白质。AKT1与核心蛋白质TNF、IL6、NOS2、MMP9均为炎症相关靶点，是菊花抗炎发挥清热解毒功效的重要靶蛋白。AKT1为致癌基因，是AKT家族的重要一员，在增殖、凋亡等细胞进程及炎症反应中发挥重要作用［21，22］。菊花可能是通过抑制AKT磷酸化减少炎性因子IL6、TNFα的释放，缓解机体的炎症反应。一氧化氮（NO）为重要的炎症介质［23］，菊花可能是通过作用于靶点NOS2，抑制NO的影响，张星海［3］证实菊花提取液干预炎症小鼠后炎症症状明显改善，血清中NO显著降低。菊花还可能是通过调控MMP9的表达，改善炎症临床表现发挥清热解毒功效的抗炎机制［24］。通过靶点定位分析发现，菊花主要靶点分布于肺脏与肝脏，与菊花归经一致，这可能是菊花有效治疗热毒引起的目赤、风热证的原因之一。综上所述，菊花清热解毒的功效可能与槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇等化合物作用AKT1、TNF、IL6、NOS2、MMP9等核心靶点，调控炎症和免疫相关信号通路，抑制炎症反应有关，菊花清热解毒的物质基础与分子机制的确定还需通过生物学实验进一步的研究与验证。