佟岩，黄荟，王辉,2，李树云，王雨华

(1.植物医生研发中心，资源植物与生物技术重点实验室，云南省野生资源植物研发重点实验室，中国科学院昆明植物研究所，云南 昆明 650201；2.中国科学院大学，北京 100049)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraet et Migo)，属兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生草本植物[1]。我国民间对铁皮石斛的应用始于2 000多年前，以新鲜或干燥茎入药，其干燥茎习称“铁皮枫斗”,是我国传统名贵中药材[2]。铁皮石斛富含多糖、生物碱、黄酮类、氨基酸、联苄类、芪类及其衍生物、酚类化合物、木质素类化合物等次生代谢产物[3]。现代药理学研究表明铁皮石斛对肠胃病、心脑血管病、糖尿病、肿瘤等都有一定的疗效，同时还具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力等功效[4-6]。石斛多糖是铁皮石斛主要的活性成分和品质决定因子，属水溶性多糖，结构复杂，是一类由单糖缩合形成的糖苷键连接而成的多聚化合物，其含量因品种、发育阶段、生长环境等的不同而有差别，水解后产生葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等单糖，这些单糖通过不同的组合构成石斛多糖除了作为营养物质贮藏外还参与铁皮石斛生长发育、能量代谢及其应激和防御反应，有着复杂的基因调控网络[7-11]。20世纪以来，铁皮石斛益胃生津、滋阴清热等独特的药用价值和广泛的保健效果被全面开发，铁皮石斛多糖提取液的测试发现其可以在皮肤上安全使用，同时还拥有良好的保湿效果和清除自由基的能力，显示铁皮石斛除传统药用价值外在化妆品开发利用中的巨大潜力[12-13]。

野生铁皮石斛自然分布于安徽西南部、浙江东部、福建西部、广西西北部、四川、云南东南部[1]。多附生于海拔1 600 m以下温暖湿润、空气畅通的半阴湿地的树木或岩石上，也生长于开阔暴露阳光直射强烈的岩层峭壁上，有较强的环境适应性[14]。铁皮石斛对光强的适应性是和其具有特殊的光合代谢途径有关，铁皮石斛具有兼性景天酸代谢(crassulacean acid metabolism,CAM)植物的特点，其光合碳代谢途径随环境变化可以在CAM途径和C3途径间转换[15]。虽然铁皮石斛具有较强的抗干旱的能力，但它对冰点以上的低温极度敏感[16]。铁皮石斛自然分布区主要在北纬30°以南地区，温度是其分布、生长发育和产量的重要限制因子，尤其是低温造成的冷害、冻害，严重影响其生存、产量和品质[17]。因此，研究铁皮石斛的耐寒性具有重要的科学意义和应用价值。通过0 ℃低温处理20 h的铁皮石斛叶片与20 ℃对照组的转录组和代谢组学联合分析发现，铁皮石斛在冷驯化过程通过激活高能量需求的糖水解、氨基酸分解代谢和柠檬酸循环等途径来提高铁皮石斛的抗寒性，CBF、MAPKKK16蛋白激酶等诸多基因的表达水平受到显著影响[18]。可见，植物对低温胁迫的响应是个复杂的调控过程，包括信号的转导、逆境响应相关基因表达的启动以及抗逆相关代谢反应的诱发等。

植物多糖除了能储存能源之外还是不可或缺的结构单元，其积累依赖于多种单糖的组装合成，同时这些单糖还可作为信号分子调节植物生长发育中的一系列生理活动[19]。铁皮石斛多糖的组成和调控非常复杂，目前已对一些重要的基因有所研究，如：蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)是调控蔗糖合成的关键酶之一，对光合产物的转运和积累有重要影响，其水解产物及衍生物是石斛多糖重要的组成物质[20]。类纤维素合成酶基因(cellulose synthase-like,Csl)的CslA亚家族基因参与了铁皮石斛甘露糖的生物合成，并具有重要作用[21-22]。UDP-阿拉伯吡喃糖变位酶(UDP-arabinopyranose mutase,UAM)是一种吡喃糖-呋喃糖变位酶，参与合成细胞壁多糖和糖蛋白，对铁皮石斛多糖合成尤其是在细胞壁多糖生物合成过程中具有重要作用[23]。UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase)是糖代谢中的关键酶，催化尿苷三磷酸(uridine triphosphate,UTP)+葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)↔UDP-葡萄糖(UDPG)+焦磷酸(pyrophosphoric acid，PPi)的可逆反应，而UDPG是蔗糖、淀粉、纤维素、半纤维素、糖原及其他寡糖和多糖的葡萄糖基供体，参与多糖类物质的合成代谢[24-25]。在叶片中，UGPase主要参与蔗糖的合成其催化生成的UDPG提供给SPS(蔗糖磷酸合成酶)或SS(蔗糖合成酶)进一步合成蔗糖，此外，UGPase也参与蔗糖的降解、淀粉合成及细胞壁合成等[26]。另外，在对灵芝多糖合成及何首乌的研究中还发现磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase,PGM)作为碳代谢途径中的一个关键的分支酶可催化葡萄糖-6-磷酸(Glc-6-P)和葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)之间的相互可逆转化，在UGPG的作用下生成UDP-葡萄糖从而转化为多糖中的其他单糖组分[27]。UDP-鼠李糖合酶(RHM)则以UDP-Glc为底物连续催化合成UDP-鼠李糖(UDP-Rha)为进一步合成L-鼠李糖及苷提供重要的糖供体，进而构成鼠李糖多糖参与细胞壁的形成，在生长发育过程中发挥重要作用[28]。

本研究选择了7个在铁皮石斛及其他药用植物多糖研究中经验证参与蔗糖、鼠李糖、淀粉、细胞壁多糖等重要多糖组成物合成途径中的重要限速酶、合成酶基因。通过这些基因在铁皮石斛不同组织和低温胁迫下不同的表达模式，探讨多糖合成基因对铁皮石斛生长发育的调控作用及低温胁迫对多糖合成基因的影响。为解析低温对铁皮石斛多糖合成的影响、铁皮石斛的抗寒机制及遗传改良提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料及处理

本实验用铁皮石斛采自云南省普洱市石斛种植基地栽种的浙江种源。引至中国科学院昆明植物研究所人工气候室中[昼温(25±2)℃，夜温(15±2)℃，光周期为光照12 h/黑暗12 h] 培养4个月，于2020年4月挑选生长良好无病虫害的一年生植株的成熟的根、茎、叶、花4个组织于-80 ℃液氮中速冻备用。同时选取10盆长势一致的一年生健康植株，置于低温(0 ℃)恒温避光培养箱(Haier)模拟夜间低温处理，从处理开始的0、4、8、12、16、20和24 h共7个时间点取成熟叶组织于液氮中速冻，-80 ℃保存备用。每个组织或时间点样品选3株取样品，处理重复3次。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

参照张志勇等[25]的方法进行改良，使用改良的CTAB-LiCl法提取铁皮石斛根、茎、叶、花4个组织及低温胁迫下7个不同时间点叶片样品的总RNA。使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(Tiangen,China)反转录试剂盒将各样品RNA反转录合成cDNA，-20 ℃保存备用。

1.3 内参基因筛选

选择5个铁皮石斛中常用的内参基因：与蛋白合成和代谢相关的EF-1α和EF-1β、与细胞结构相关的Actin、与核糖体组成相关的18S、以及与糖代谢途径相关的GAPDH，用于筛选适于本研究的内参基因。各引物序列见表1，引物由擎科生物科技有限公司合成。

表1 铁皮石斛5个候选内参基因qPCR引物

1.4 qRT-PCR分析基因表达水平

选择铁皮石斛多糖合成途径中7个与蔗糖、鼠李糖、细胞壁等多糖合成相关的基因。从NCBI中搜索铁皮石斛已有的基因组和转录组数据注释的同源基因序列，用BLAST进行同源序列比对，使用Primer 6.0软件和Primer-BLAST软件设计荧光定量PCR引物(表2)。

表2 铁皮石斛多糖合成相关基因引物信息Tab.2 The related genes primer information of polysaccharide synthesis in D.officinale

以铁皮石斛根、茎、叶、花4个不同组织和0 ℃低温胁迫处理7个时间点的cDNA为模板进行PCR。反应体系(9 μL)为2×Taq Maste Mix 4.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 1.5 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃再延伸5 min，40个循环。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测150 V 20 min。

用Bio-Rad CFX-96(Bio-Rad laboratories,Hercules,CA,USA) 进行qRT-PCR实验，实验设置3个重复。反应体系为10 μL：2×SuperReal PreMix Plus(SYBR Green,TIANGEN),cDNA 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，1 μL 50×ROX Reference Dye，补充ddH2O至10 μL总体系。

实时荧光定量PCR反应程序 95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸10 s，40个循环，70～95 ℃熔解曲线：0.5 ℃,5 s，信号采集。

1.5 数据处理分析

利用Microsoft Excel 2007处理基因的Ct值，使用GraphPad Prism 7作图。根据筛选出的内参基因，检测铁皮石斛多糖合成相关基因在4个不同组织中的表达差异以及低温胁迫下的表达水平变化模式，表达量计算使用2-ΔΔCT方法。设置不同组织间表达差异以叶片的基因表达量为1，温度胁迫处理则以0 ℃、 0 h叶片的基因表达量为1进行对比，表达量大于1表示基因上调，表达量小于1表示基因下调。用SPSS 18.0软件的Student’st-test计算表达差异的显著性(*P<0.05为显著，**P<0.01为极显著)。

2 结果与分析

2.1 RNA检测与候选内参基因引物特异性分析

对提取的铁皮石斛根、茎、叶、花4个组织及冷胁迫处理不同时间点叶片的RNA用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示各组织和冷处理RNA的18S和28S条带完整无拖尾，说明提取的RNA完整性较好。用Nanodrop ND 2000(DE,USA) 检测RNA的浓度，RNA的A260/A280值在1.9～2.1之间，A260/A230值在2.0～2.3之间，表明RNA的纯度高，可用于cDNA合成。

用铁皮石斛避光0 ℃胁迫0 h的叶片cDNA为模板5个候选内参基因进行PCR，2%琼脂糖检测电泳结果(图1A)显示GAPDH基因的扩增产物良好，无二聚体，且在铁皮石斛中具有特异性。进一步以所有样品cDNA为模板用GAPDH基因进行PCR，产物电泳检测(图1B)显示GAPDH基因可以在低温胁迫的各时间点均可稳定良好表达，此外，GAPDH内参基因引物的熔解曲线和标准曲线呈现单一峰表明引物特异性较好，结果表明在5个候选内参基因中GAPDH基因是最适合于本实验的内参基因。

图1 2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

2.2 7个多糖合成相关基因在铁皮石斛4个不同组织中的表达差异分析

采用qRT-PCR方法对铁皮石斛根、茎、叶、花4个不同组织中7个多糖合成相关基因的相对表达量进行分析，结果显示(图2)，所有基因在铁皮石斛不同组织中均有表达，每个基因的表达模式各不相同，但共同表现为在花和根中的表达量均高于在叶片中的表达量。其中，UAM基因在花和根中有高表达，是叶和茎的13～18倍。PGM基因在叶、花、根中的表达量相当，在茎中低表达仅为叶的0.18倍。UGP基因在叶和茎中表达量相当，在花中高表达是叶中的20倍。CSLA4基因在茎和根的表达量均比叶高，在花中表达量更是高达叶中的59倍。RHM1基因在叶和茎中的表达量相当，在花和根中高表达，是叶中的9倍(花中)和3倍(根中)。SPS基因在茎和叶中的表达量相当，花和根中的表达量分别是叶的27倍和9倍。CSLA1基因在花、茎、根中的表达量均比叶中的高，分别是叶中表达量的2倍、3倍和5倍，在根中的表达量最高。

图2 不同组织中多糖合成相关基因表达量的变化热图分析Fig.2 Heatmap of the change of seven genes encoding polysaccharide synthesis in four different tissues

2.3 低温胁迫下7个铁皮石斛多糖合成相关基因的表达差异分析

本研究以GAPDH为内参基因，利用qRT-PCR分析7个铁皮石斛多糖合成相关基因在避光0 ℃低温胁迫下7个时间点的相对表达水平变化，结果显示(图3)，所有基因均表现出在受胁迫后的短时间(4 h)内出现表达量急剧下调呈现先受到抑制的现象，随着胁迫时间的延长不同基因表现出不同的表达模式。在低温胁迫的24 h中PGM基因表现出受到持续的显著抑制作用。UAM基因呈现先下调后上调再下调的波动变化，在20 h时表达量最高为0 h的1.3倍。UGP基因在短时间的下调后在8～20 h期间上升至与0 h相当水平到24 h显著下调为0 h的0.1倍。CSLA4基因则在12 h时表达量显著上调为0 h的4.1倍，随后又逐渐下降。RHM1基因在4～20 h一直处于低表达量水平到24 h上调至0 h的1.7倍。SPS基因在4～20 h之间一直处于被抑制表达到24 h恢复至0 h表达量水平。CSLA1基因在12 h时表达量升高至0 h的2倍，随胁迫时间增加而降低，至20～24 h表达量均高于0 h。

图3 低温胁迫对铁皮石斛多糖合成途径相关基因表达的影响Fig.3 qRT-PCR analysis on the expression patterns of genes in polysaccharide synthesis under low temperature treatment

3 讨论与结论

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术目前已广泛应用于基因表达水平分析研究中，但其结果受RNA质量、引物特异性、内参基因稳定性等多种因素的影响。其中，内参基因的稳定性是qRT-PCR结果准确性和可重复性的保障。虽然科研工作者一直致力于寻找一种或几种在所有生理状态下的细胞和样品类型中均能较稳定地表达的理想内参基因。但遗憾的是近年来的大量研究表明，并没有表达绝对稳定的基因，任何一种看家基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下的稳定，因此，根据不同物种、样品材料和实验条件筛选合适的内参基因至关重要。在铁皮石斛物种中Actin、EF-1α、18S、GAPDH、EF-1β基因在前人的研究中都曾根据自身研究内容而选择作为内参基因[29-30]。本研究结果表明与糖代谢途径相关的GAPDH基因在铁皮石斛根、茎、叶、花4个不同组织及低温胁迫叶片中表达水平稳定性较高，更适合作为内参基因用于本研究中多糖合成相关基因在铁皮石斛不同组织中和低温胁迫处理下基因表达的差异分析。

在铁皮石斛中，UAM、PGM、UGP、CSLA、RHM和SPS与多糖合成相关的基因在生长发育旺盛的花和根组织中的表达量均高于在成熟的叶和茎组织中的表达量，表明这些基因均参与了铁皮石斛的生长发育过程。尤其是UGP、CSLA4和SPS基因，其在根和花组织中的表达量分别是叶组织中的20、59、27倍和6、8、10倍，表达量差异揭示这3个基因在铁皮石斛花和根的生长发育过程中起到了重要的调控作用。CSLA基因参与合成的甘露聚糖是细胞壁的构成和生长发育过程所需的重要物质[21-22]。而UGP和SPS基因参与合成的蔗糖则主要为植物生长发育提供碳架和能量，在许多植物的成花转变和花器官发育过程中都起着及其重要的作用[31-32]。另外，本研究中的PGM基因经比对鉴定为质体型PGM基因，是参与淀粉合成的关键酶基因之一，其在根和花中的表达量与叶中相当，但在茎中表现为显著低表达。质体型PGM在菠菜(Spinaciaoleracea)[33]和拟南芥(Arabidopsisthaliana)[34]中被发现定位于叶片的叶绿体中，对过渡淀粉的合成至关重要。He等[21]对铁皮石斛茎中的水溶性多糖组成和淀粉含量的测定发现铁皮石斛茎中的淀粉含量很少(不到10%)，石斛多糖主要为非淀粉多糖，以水溶性多糖为主。

在低温处理的24 h中，铁皮石斛叶片中质体型PGM基因一直呈显著下调表达，基因表达受到显著抑制。在高等植物中，磷酸葡萄糖变位酶(PGM)分为质体型PGM(pPGM)和胞质型PGM(cPGM)，分别定位在叶绿体上和细胞质中，其质体型PGM(pPGM)对Glc-1-P的形成至关重要，是淀粉形成的重要酶[34]。低温处理下铁皮石斛RHM基因和SPS基因在胁迫前20 h一直呈显著下调，表达受抑制，直至24 h才上调恢复至与0 h对照表达相当水平。RHM是鼠李糖合成的关键酶，并通过糖苷键将活化的鼠李糖与小分子连接起来构成鼠李糖多糖参与细胞壁的形成及生长发育过程[35]。蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性反映蔗糖生物合成途径的能力，与蔗糖的形成呈正相关。已有研究发现SPS基因的表达受光周期调控影响，黑暗处理会抑制SPS基因的表达，而低温胁迫会上调SPS基因的表达[36-37]。铁皮石斛叶片UGP、UAM和CSLA基因在胁迫处理下则呈现先下调后上调再下调表达的波动。已有研究表明铁皮石斛多糖的积累受昼夜温差变化影响，昼夜温差10 ℃(25/15 ℃)是最适促进多糖积累的温度，夜间温度过低(25/10 ℃)昼夜温差(15 ℃)大会呈现随处理时间增加呈先增加后下降的趋势[38]。而夜间12 ℃可能是薄皮甜瓜(CucumismeloL.)糖代谢发生改变的临界低温，到夜间9 ℃则严重影响其糖积累及代谢中的相关酶活性[39]。

综上所述，GAPDH基因可作为内参基因用于铁皮石斛不同组织及低温胁迫基因表达水平研究中。7个与多糖合成相关的基因在铁皮石斛生长发育中也起到一定的调控作用。而夜间0 ℃低温对铁皮石斛多糖合成相关基因的表达有显著的影响。这些研究结果为研究低温对铁皮石斛多糖合成的影响、解析铁皮石斛抗寒机制及其种质资源的改良提供科学依据。