吴 雪，张 继，刘若余，胡 焱

(1. 贵阳市乌当区农业农村局，贵州 贵阳 560018； 2. 遵义职业技术学院，贵州 遵义 563000；3. 贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)，又称蛋白磷酸酶2B(Protein phosphatase 2B，PP2B)，是目前已知的唯一受Ca2+和钙调素(Calmodulin，CaM)调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶[1]，是由催化亚基(CnA)和调节亚基(CnB)构成的1种异源二聚体[2，3]。CnA有3种亚型：CnAα、CnAβ、CnAγ，分别由PPP3CA、PPP3CB、PPP3CC基因编码；PPP3CC仅在睾丸中表达，PPP3CA和PPP3CB则广泛分布于动物体内各组织中，但PPP3CA的丰度显著高于PPP3CB[4，5]。CnB在机体内由PPP3R1和PPP3R2基因编码，PPP3R1主要在骨骼肌中表达，而PPP3R2则主要在生殖系统中表达[6]。可见动物体内CaN的主要编码基因为PPP3CA和PPP3R1。CaN的生理功能涉及到细胞生长发育、机体免疫应答乃至神经元的集合和活化等多种生命活动[7，8]。CaN于1979年首先在脑组织中被发现，神经系统和T淋巴细胞中含量也很丰富，心血管系统和骨骼肌、肺脏、脾脏、肝脏、肾脏中均有存在，被认为是生物体应激反应时的中心调节蛋白。近年来研究发现，CaN 在多种细胞增殖分化中(如骨骼肌再生)有重要作用，使得CaN在器官移植免疫方面也成为研究的热点。此外CaN对肌纤维类型也有重要调控作用，而不同肌纤维类型组成又决定肉品质的优劣，因此CaN的编码基因变异和基因表达必然对畜禽肉品质有着重大的影响。本研究通过检测CaN的2个主要编码基因PPP3CA和PPP3R1在江口萝卜猪不同月龄和组织中的表达情况和规律，为鉴别影响肉质的主效基因和挖掘良好的分子育种标记提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物选取0、2、4、10月龄的江口萝卜猪各3头，屠宰后取脾、肾、肺、肝、心、胃、十二指肠、腰大肌、背最长肌9个组织，生理盐水冲洗后立即放入装有RNA保存液(RNA Protector)的冻存管中，置于 -80 ℃超低温冰箱保存，用于提取RNA。

1.2 主要仪器超净工作台(型号BBS-H1500，山东博科)、PCR仪(型号PTC200，美国Bio-Rad)、超微量紫外分光光度计(型号NanoDrop ND-2000，美国Thermo)、实时荧光定量PCR仪(型号CFX96，美国Bio-Rad)。

1.3 主要试剂组织样品RNA保存液(DP408，康为世纪)、TRIzol(RNAiso Plus，日本 TaKaRa)、RNase-Free Water(北京索莱宝)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis(K1622，美国Thermo Fisher Scientific)、2×TaqMasterMix(康为世纪)、iTaqUniversal SYBR Green Supermix(美国 Bio-Rad)。

1.4 总RNA提取采用TRIzol法分别提取0、2、4、10月龄江口萝卜猪的心、肝、脾、肺、肾、胃、腰大肌、背最长肌、十二指肠9个组织的总RNA。 用 1%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性，取RNA 2 μL 与10×loading buffer混合均匀，180 V电压电泳15 min。

1.5 cDNA第一链合成用无RNA酶去离子水将提取的各组织总RNA浓度均稀释至500 ng/μL，cDNA第一链合成反应参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书进行。

1.6 实时荧光定量PCR

1.6.1 引物的设计与合成根据NCBI登录的猪PPP3R1(登录号：XM_021087426.1)、PPP3CA(登录号：NM_214128.1)基因mRNA参考序列，以及内参基因β-actin，运用primer premier 5软件共设计3对特异性引物(为了提高引物特异性，引物均跨外显子设计)，均由生工生物工程有限公司合成。引物信息见表1。

表1 引物信息

1.6.2 PCR反应荧光定量PCR每个样品做3个重复。(1)PCR反应程序：预变性95 ℃ 10 min；变性95 ℃ 10 s，退火30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40个循环。绘制熔解曲线：95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，每10 s上升0.5 ℃。(2)PCR反应体系20 μL：2×iTaqUniversal SYBR Green Supermix 10 μL，10 pmol/μL上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。

1.7 数据统计分析根据荧光定量PCR系统内置程序分析荧光定量PCR结果，其中加样误差超过0.5的样品重做。导出数据，用2-△△Ct法计算PPP3R1、PPP3CA基因在各组织中的相对表达量，用单因素方差分析检验各组基因表达量的差异显著性，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取由图1可见：28 S、18 S、5 S rRNA电泳条带清晰明亮，且28 S条带亮度是18 S的2倍，无拖尾和弥散，证明提取的RNA质量高、完整性好。超微量紫外分光光度计检测结果显示，总RNA浓度均在500 ng/μL以上，D260/280 nm值在1.8～2.0之间，说明RNA浓度纯度均符合试验要求(大于2.0表明RNA有降解，小于1.8说明RNA存在蛋白质残留污染)，可用于逆转录反应。

1：心； 2：肝； 3：脾； 4：肺图1 RNA电泳图谱

2.2 PCR扩增由图2可见：PPP3R1、PPP3CA基因以及内参基因引物扩增片段单一且清晰明亮，无明显的拖尾和引物二聚体，对照DNA Marker可以看到片段大小与试验设计片段大小相符，符合实验预期结果，证明各引物特异性好，可用于下一步试验。

PPP3R1 PPP3CA β-actinM：DL 2 000 DNA Marker； 1：PPP3R1基因PCR扩增片段； 2：PPP3CA基因PCR扩增片段； 3：β-actin内参基因PCR扩增片段图2 各基因PCR扩增

2.3 实时荧光定量PCR荧光定量PCR扩增曲线和熔解曲线见图3、图4、图5：扩增曲线基线平直，拐点清楚，整体平行性好，说明各个反应管中扩增效率相近，斜率大，扩增效率高；Ct值在20～30之间，说明模板浓度适宜；熔解曲线呈现单一峰，熔解温度在80～90 ℃之间，说明引物特异性好，无引物二聚体和非特异性扩增。

图3 PPP3R1基因的扩增曲线与熔解曲线

图4 PPP3CA基因的扩增曲线与熔解曲线

图5 β-actin基因的扩增曲线与熔解曲线

2.4PPP3R1、PPP3CA基因组织表达差异

2.4.1 不同月龄PPP3R1表达量差异分析由图6可见：除十二指肠外大部分组织中PPP3R1的表达较稳定，不同月龄之间表达量差异不显著。在背最长肌、十二指肠、胃、腰大肌中有随月龄增加而上升的趋势。10月龄时在十二指肠中的表达量显著高于其他3个月龄，且2、4月龄显著高于0月龄，有随月龄增加而大幅上升的趋势。10月龄时在腰大肌中的表达量显著高于其他3个月龄。

图6 PPP3R1基因在不同生长阶段各组织中的表达注：图柱中标记不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或未标记表示差异不显著(P>0.05)。下图同

2.4.2 相同月龄不同组织中PPP3R2表达量差异分析由图7可见：PPP3R1基因在腰大肌、背最长肌中的表达量最高，在4个月龄段中均显著高于其他7个组织。在心脏中表达量最低，4个月龄段均显著低于其他组织。在十二指肠、肺、肝、脾、肾、胃6个组织中均有不同程度的表达，除在2、4、10月龄十二指肠中的表达量均显著高于肾以外，总体差异不显著。

图7 PPP3R1基因在相同生长阶段各组织中的表达

2.4.3 不同月龄PPP3CA表达量差异分析由图8可见：背最长肌、心、腰大肌中的PPP3CA表达量随月龄增加而大幅上升。在背最长肌中的表达量2、4、10月龄差异不显著，但均显著高于0月龄；在心、腰大肌中的表达量为4月龄和10月龄显著高于0月龄和2月龄，2月龄又显著高于0月龄，可以看出PPP3CA表达量有随着月龄增加上升幅度越来越小，逐渐趋于稳定的趋势。在其他组织中的表达量除脾中有小幅上升趋势以外，未见明显随月龄变化的规律。

图8 PPP3CA基因在不同生长阶段各组织中的表达

2.4.4 相同月龄不同组织中PPP3CA表达量差异分析由图9可见：腰大肌、背最长肌、脾中PPP3CA表达量较高，均显著高于其他组织，分别为背最长肌>腰大肌>脾。除肾脏中表达量较低(2月龄外的3个月龄均显著低于其他组织)，以及心脏表达量0月龄时显著低于其他组织之外，在其他组织中的表达总体差异不显著。

图9 PPP3CA基因在相同生长阶段各组织中的表达

3 结论

PPP3CA和PPP3R1基因在腰大肌、背最长肌中的表达量最高，并且随着月龄的增加而升高，说明PPP3CA和PPP3R1基因对江口萝卜猪腰大肌、背最长肌的生长发育有重要调控作用，由此推断对其他骨骼肌的生长发育也有类似作用。

4 讨论

4.1CaN作为参与动物多种细胞功能的重要调控因子，既可以介导活化T细胞核因子(NFAT)转录因子，使其进入细胞核，激活基因转录，促进纤维类型转化，也可以通过Ca2+介导的CaN/SSH-cofilin调控通路参与调控的肌纤维生长发育和类型转化[9，10]。CaN自身也可以作为信号分子，诱导Ⅰ型肌纤维特异基因启动子活性上调，使Ⅱb和Ⅱx型肌纤维向Ⅱa和Ⅰ型肌纤维转化。因此，CaN的编码基因PPP3R1和PPP3CA可以视为影响畜禽肉质品质的重要候选基因，但关于PPP3R1和PPP3CA基因结构和变异的分析鲜见报道。

4.2本研究结果发现PPP3R1基因和PPP3CA基因表达规律大致相同，在个别组织中略有差异。在相同生长阶段，腰大肌、背最长肌中PPP3R1基因和PPP3CA基因表达量均显著高于其他组织，背最长肌和腰大肌中PPP3R1基因表达量差异不显著，但背最长肌中PPP3CA基因表达量显著高于腰大肌，这与Depreux E F和Wan L等[11，12]的研究结果一致。其原因是PPP3CA基因在快肌纤维中含量高于慢肌纤维，所以造成不同类型肌肉中表达存在一定的差异[13]。在心脏中PPP3R1基因表达量最低，4个月龄段均显著低于其他组织，且随月龄变化不大；而PPP3CA基因表达量随月龄增加大幅上升，2月龄后与其他组织相当。在十二指肠、肺、肝等6个组织中PPP3R1基因和PPP3CA基因均有不同程度的表达，除脾中PPP3CA基因表达量相对较高以外，总体表达规律差异不显著。此外这2个基因在不同月龄江口萝卜猪的大部分组织中表达较稳定，只在背最长肌、腰大肌，以及其他个别组织中有随月龄增加而上升，但随着月龄增加上升幅度越来越小，逐渐趋于稳定的趋势。推测可能是因为刚出生的一段时间为生长发育最为迅速的时期，机体内的酶和信号分子合成活跃，而随着年龄增大逐渐趋于稳定，处于动态平衡。PPP3R1基因和PPP3CA基因之间的表达差异可能是因催化亚基和调节亚基各自行使的生理功能不同所致，但具体原因还需要更深入的研究。