常金梅，张鲁斌

(1 岭南师范学院，广东湛江，524091；2 嘉应学院/广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东梅州，514000)

菠萝黑心病亦被称为菠萝内部褐化病、小果心腐病、小果褐腐病等，是菠萝主栽品种巴厘的主要采后病害之一[1]，常在采后贮藏和运输过程中发生[2]。菠萝黑心病发生时表现为果实外部无任何症状，横剖后果心周围果肉褐变，通常是小果基部或中部先出现半透明的水浸状或浅褐色的小斑点，随着发病程度的加深，褐色斑点互相联结成一片，并向果髓发展，最终果髓甚至果肉都变为黑褐色，导致果实品质劣变，失去商品价值[3]，严重影响菠萝产业和进出口贸易发展。该病害的生理机制尚不清楚。目前，国内外尚无有效控制黑心病的方法，因此，黑心病作为菠萝产业最普遍最重要的问题倍受关注[4-5]。

酚类是植物抗病反应的主要生化物质，也是果实发生褐变的主要底物之一，是一类苯环上含有1个或多个羟基的芳香族衍生物，能够被逆境的生物和非生物因子诱导合成[6-7]。植物体内的酚类物质代谢是一个错综复杂的过程[8]。菠萝果实黑心病的发病机理复杂，其主要特征是褐变，本质是邻苯二酚、表儿茶酚、儿茶酚和绿原酸被多酚氧化酶氧化为醌类物质，继而通过非酶促聚合生成黑色素而使组织变成褐色[9]。另有研究表明，果实酶促褐变起主要作用的酶包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)等[10]。本研究主要针对采后菠萝黑心病发病过程中总酚含量变化及其代谢相关酶活性变化进行系统研究，为明确菠萝黑心病发生的生理机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

“巴厘”Ananascomosus(L.) Merr. cv. Comte de Paris，感病品种；“无刺卡因”Ananascomosusr(L.) Merr. cv. Cayenne，抗病品种。

1.2 方法

1.2.1 材料处理及取样方法 将田间采收的七八成成熟、大小均匀、无机械损伤的“巴厘”和“无刺卡因”果实，保留顶芽，留果柄长1 cm，待田间热散去，将菠萝果实放入塑料框中，然后将塑料筐置于聚乙烯袋中，轻掩，常温(25 ℃)贮藏，在果实黑心病发生过程中，及时拍照、取样。

取样方法：“无刺卡因”取果实中部距离果心1 cm处的果肉，“巴厘”菠萝病健部分开取样，健康部位指赤道部位距果皮0.5 cm的果肉，发病部位指果梗与果肉交接处。每处理重复 3 次，每次随机取果实10个，将果肉切成小块，液氮速冻，用高速粉碎机碾成粉末状，做标记后于-80 ℃保存。

1.2.2 病情指数测定 果实黑心病分级：0级，无病斑；1级，病斑面积占果实面积的5%以下；3级，病斑面积占果实面积的6% ～25%；5级，病斑面积占果实面积的26% ～50%；7级，病斑面积占果实面积的50%以上。调查发病情况，计算病情指数。病情指数= ∑ (各级病果数×各级代表值) / (调查总果数×7)×100；

1.2.3 总酚的测定 参考徐辉艳等[11]的方法略作改动，取样品1 g，加入80 ℃蒸馏水10 mL，80 ℃水浴40 min，期间摇动数次，取出冷却后，过滤，定容至20 mL。以不同浓度没食子酸标准品溶液绘制标准曲线，取滤液1 mL，加入水5 mL，福林酚试剂1 mL， 10%Na2CO33 mL，放置2 h，于765 nm下测吸光度值，重复3次，单位mg/g。

1.2.4 2，8-二羟甲基蒽醌的测定 参考金乾兴等[12]的紫外分光光度法略作改动，取样品1 g，加60%乙醇20 mL，80 ℃下超声40 min，过滤，留滤液备用。以不同浓度的2，8-二羟基蒽醌标准品溶液绘制标准曲线，然后取滤液5 mL，用60%乙醇定容至10 mL，224 nm处测吸光度值，重复3次，单位mg/g。

1.2.5 酚类代谢相关酶活性的测定 PPO活性测定参考陈瑞琴等[13]的方法，POD、PAL、CAT活性测定参考刘晓阳等[14]的方法。

1.3 统计分析方法

数据应用软件Microsoft Excel和SPSS 19.0进行处理和统计分析，采用Duncan′s法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 黑心病的发生情况

贮藏过程中，“巴厘”发生黑心病比较普遍，其黑心病在贮藏第4天开始零星发生；第6天时，发病率达到80%，病斑较小，病情指数15.24，之后病斑快速扩展；第10天时，发病率达到了100%，病情指数70，果实完全失去了食用价值(见图1)；而“无刺卡因”在整个贮藏过程中均没有发生黑心病。

图1 常温(25 ℃)贮藏下“巴厘”菠萝果实黑心病发生情况

2.2 总酚含量变化

贮藏过程中，“无刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉总酚含量均无明显的变化，“无刺卡因”果实总酚含量显著高于“巴厘”。“巴厘”病部果肉中，总酚含量呈先上升后下降的趋势，从贮藏第4天开始总酚含量开始快速上升，到第6天达到高峰，为0.41 mg/g，是健康部位的1.43倍；且在第4、6、8天时，其含量显著高于“巴厘”健康部位，与黑心病发病时间相符(见图2)。

2.3 2，8-二羟甲基蒽醌含量变化

“无刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉中2，8-二羟甲基蒽醌含量没有明显波动，但“无刺卡因”中其含量显著高于“巴厘”。在“巴厘”发病部位，2，8-二羟甲基蒽醌含量从第4天开始增加，且显著高于健康部位，第8天时为健康部位的2.34倍，之后略有下降(见图2)。

图2 常温(25 ℃)贮藏下“巴厘”和“无刺卡因”菠萝果实总酚和2，8-二羟甲基蒽醌含量变化

2.4 酚类代谢相关酶活性变化

在贮藏过程中，0～8 d时“无刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉PPO活性较稳定，且“巴厘”的PPO活性显著高于“无刺卡因”，第10天时”巴厘”健康部位PPO活性也出现升高。“巴厘”发病部位果肉PPO活性从第6天开始升高，第8天达到最高值，为55.86 0.01A/min·FW，为健康部位的2.12倍，之后一直维持在较高水平。

在“无刺卡因”以及“巴厘”健康部位和发病部位，果肉过氧化物酶POD活性均呈下降趋势，“无刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉POD活性均无显著性差异；从第6天开始，“巴厘”发病部位果肉POD活性显著低于健康部位，第10天时POD活性下降了92.57 0.01A/min·FW，而健康部位只下降了45.94 0.01A/min·FW，下降速度差异显著。

整个贮藏过程中“无刺卡因”果肉CAT活性较低，最高只有1.18；“巴厘”菠萝健康部位和发病部位果肉CAT活性均先上升后下降，但从第6天开始，发病部位果肉CAT活性显著低于健康部位。

“无刺卡因”和“巴厘”健康部位果肉PAL活性均呈现缓慢上升趋势，且“无刺卡因”的PAL活性均显著高于“巴厘”。“巴厘”发病部位PAL活性呈先上升后下降的趋势，在第4天时达到最高值，为25.83 0.01A/min·FW，之后快速下降；到第10天时仅为11.83 0.01A/min·FW，显著低于健康部位(见图3)。

图3 常温(25 ℃)贮藏下“巴厘”和“无刺卡因”菠萝果实酚类代谢相关酶活性变化

3 结论与讨论

酚类化合物是植物体内重要的次生代谢物质，酚类物质及其氧化产物——醌的积累是植物对病原菌侵染和损伤的非专化性反应。反之，植物受到损伤时，必然也在一定程度上影响到植物体内原有的酚类代谢平衡[8]。本研究中，由于“巴厘”菠萝在贮藏过程中黑心病发生比较普遍，因此分别取发病部位和健康部位做对比，并以抗黑心病的“无刺卡因”菠萝作为对照进行研究。菠萝发病部位果肉总酚含量变化显著，从第4天开始含量显著提高，一直到第6天达到峰值，这也是菠萝果肉褐化加剧的时期。有研究表明，酚类物质是酶促反应褐化的底物[15-16]，因此酚类物质含量的提高，使褐化底物增加，在相关酶的作用下被氧化为醌类物质，醌类物质进一步聚合成黑色素，从而发生黑心病。之后，随着病情的进一步加剧，总酚被逐步消耗，开始出现下降的趋势。

酚类物质酶促氧化是果实褐变的关键，PPO、POD 和 PAL是影响果实褐变的关键酶[17]。PPO使酚类物质发生反应导致果实褐变，POD是果实褐变的保护酶，但在H2O2存在时也可通过催化酚类物质、类黄酮的氧化聚合导致果实褐变[18]。PAL是苯丙烷代谢途径中酚类、植保素和木质素等抗菌物质合成的关键酶，一般认为PAL活性的增强对植物抗病是有利的。周玉婵等研究认为PPO是菠萝黑心病致病的关键酶，低温和GA3处理可提高PPO和PAL的活性并增加PPO底物的含量，使酶促氧化反应更易进行，导致黑心病的发生[19]。本研究中，随着果实黑心病发生，病部PPO活性显著增强；“巴厘”健康部位和“无刺卡因”的果肉PPO活性则未出现明显的变化，且前者一直高于后者，与“无刺卡因”一直没有发生黑心病的现象相符，表明在菠萝黑心病的发生过程中PPO发挥了重要的作用。对荔枝、冬瓜、龙眼、菊芋、中华寿桃等研究也表明PPO与酶促褐化有密切关系[20-24]；陈瑞琴、刘保华等研究还表明了PPO是引起荔枝果皮酶促褐变最主要的酶之一，PPO活性越高褐化越严重[13]。本研究结果也支持PPO与菠萝酶促褐化有密切联系，PPO活性越高黑心病发生越严重。有研究报道，许多植物在遭受机械伤害、寒冷、微生物侵染等不良环境时，植物体内的防卫系统特别是苯丙烷类被激活，体内PAL活性上升[25]。本研究结果显示贮藏0～4 d时，患病部位PAL活性升高，第6天时出现快速下降，显著低于健康部位，POD活性也在第6天出现了显著下降，显著低于健康部位，由此可推测POD和PAL在菠萝贮藏过程中对黑心病的发生起抑制作用。本研究主要进行菠萝黑心病发病过程中酚类物质含量及其代谢相关酶活性变化的研究，今后可以进行不同种类酚类组成和含量的测定与分析，深入探讨褐变底物的差异对果实黑心病发生的影响。