赵静霞，高宏杰，贡磊磊，李 君

(1.中国中医科学院西苑医院麻醉科，北京 100091；2.中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700；3.首都医科大学附属北京妇产医院药事部，北京 100026)

盆腔炎(pelvic inflammatory disease，PID)是指女性上生殖道(子宫内膜、输卵管、卵巢或盆腔腹膜)感染引起的炎症，是一种具有严重生殖后遗症的女性生殖道疾病[1]。2013—2014年美国国家健康与营养调查结果显示，250万18～44岁女性获得过PID诊断[2]；2004年，由北京大学第一医院牵头组织的全国14家医院的调查结果显示，妇科门诊就诊患者中，PID患病率约为10.1%[3]。PID是育龄女性的常见病、多发病，若未得到及时、积极、正确诊疗，可引起输卵管囊肿、肝周围炎等近期后遗症和不孕症、异位妊娠、慢性盆腔炎及PID反复发作等远期后遗症，严重影响女性健康及生活质量，增加家庭和社会负担。PID的治疗主要以广谱、经验性抗菌药物治疗为主，必要时进行手术治疗[4-6]。但临床上在治疗PID时，存在抗菌药物应用不当、治疗疗程不够以及滥用抗菌药物等问题，使得常规西医治疗存在一定的局限性。中药治疗PID疗效确切、不良反应小，具有独特的优势[7]。

根据临床表现，PID属于中医学中“热入血室”“妇人腹痛”及“带下病”等范畴，其病机为湿热之邪趁虚入体，与冲任之气血相搏，瘀滞胞宫，或积郁肝经，致气滞血瘀，久则成癥，而瘀阻冲任胞脉，不通则痛[8]。康妇炎胶囊是由蒲公英、败酱草、薏苡仁、赤芍、苍术、当归、川芎、香附、延胡索、泽泻和白花蛇舌草11味中药组成的复方制剂，具有清热解毒、化瘀行滞和除湿止带的功效，针对PID，药证相符，临床疗效确切[7]。梁旭东等[9]的研究纳入了438例PID患者，随机观察不同治疗方案的疗效，发现康妇炎胶囊联合抗菌药物治疗PID的疗效显著，且安全可靠。蔡竞等[10]发现，康妇炎胶囊可通过下调PID兔前炎症细胞因子[白细胞介素(IL)8]和腹腔粘连相关细胞因子转化生长因子β(TGF-β)的表达，并提高抗炎因子(IL-4、IL-10)的表达，调整致炎和抗炎的动态平衡，促使PID性疾病的康复。何延浩等[11]建立了大鼠PID后遗症模型，发现康妇炎胶囊能够减轻PID模型大鼠的子宫炎症，提高模型大鼠的脏器指数及腹腔巨噬细胞的吞噬功能，调整大鼠机体免疫能力，从而改善大鼠PID后遗症。目前，关于康妇炎胶囊治疗PID多集中于临床及药效学研究，其治疗PID的分子机制尚无文献报道。本研究运用网络药理学方法预测康妇炎胶囊治疗PID的活性成分及其作用靶点，为进一步的体内试验和临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 康妇炎胶囊化学成分来源

基于中药分子机制生物信息学分析工具(bio-informatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)和中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)数据库，分别检索蒲公英、败酱草、薏苡仁、赤芍、苍术、当归、川芎、香附、延胡索、泽泻和白花蛇舌草等11味中药的所有化学成分，建立康妇炎胶囊化学成分库。

1.2 康妇炎胶囊靶标预测和PID靶标收集

基于BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库，收集11味中药化学成分潜在的靶点，合并所有靶点并去重，建立康妇炎胶囊候选靶标库。在人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org/)中，以“pelvic inflammatory disease”“pelvic infection”为关键词，对PID疾病靶标进行检测，对收集的靶标去重，采用DAVID 6.7数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对靶点进行标准化，建立PID靶标库。

1.3 康妇炎胶囊药物靶标与PID靶标核心网络构建、核心靶标功能及通路分析

基于String 10.5数据库(http://string-db.org)，提取康妇炎胶囊候选靶标与PID相关靶标相互作用信息，设置蛋白种类为“homo sapines”，最高置信度参数评分>0.4，其他参数不变。对参数“degree”“betweenness”和“neighborhood”进行分析，取值方式为“degree”>中位数，进一步计算“betweenness”和“neighborhood”，取满足3个拓扑结构特征值均>中位数的节点的靶标与其相互作用关系导入Cytoscape 3.5.1软件构建康妇炎胶囊成分靶标及PID靶标核心网络，并将这些核心靶标导入DAVIA 6.7数据库，采用基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析(http://www.genome.jp/kegg/)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析(http://www.geneontology.org http://www.genome.jp/kegg/)分别对核心网络靶标进行分析。

2 结果

2.1 康妇炎胶囊化学成分及其靶标预测

经过BATMAN-TCM数据库，筛选整理获得康妇炎胶囊中11味中药的化学成分共249个，预测靶标1 594个，其中蒲公英化学成分4个，预测靶标89个；败酱草化学成分17个，预测靶标265个；薏苡仁化学成分3个，预测靶标48个；赤芍化学成分9个，预测靶标50个；苍术化学成分15个，预测靶标314个；当归81个成分，预测靶标1 185个；川芎84个，预测靶标946个；香附12个，预测靶标450个；延胡索35个，预测靶标563个；泽泻14个，预测靶标168个；白花蛇舌草4个，预测靶标165个。其中29个成分重复，这些药物中的靶标之间有所重合(见表1)。蔡少青等[12]认为，中药不同化学成分可通过相继与靶标分子结合，形成叠加效应，共同发挥作用。对上述靶标合并去重后，共获得1 594个靶标。

2.2 康妇炎胶囊治疗PID核心靶标网络分析

通过OMIM数据库，收集PID相关靶标，经过DAVID数据库标准化，去重后共获得94个靶标。基于STRING数据库中的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)数据库，构建康妇炎胶囊潜在靶标与疾病靶标之间的相互作用网络。根据“degree”>中位数为节点，以此为标准，筛选“degree”“betweenness centrality”和“neighborhood centrality”3个拓扑结构特征值均>中位数的节点为关键靶标网络，根据以上条件筛选出关键靶标460个，根据“degree”显示前150个靶标，见图1。图中，节点大小与“degree”呈正相关，其中康妇炎胶囊化学成分靶标143个，PID疾病靶标11个，药物靶标和疾病靶标共4个。共有靶标有神经型一氧化氮合酶(NOS1)、CC趋化因子2(CCL2)、SRY相关高迁移率组蛋白9(Sox9)及前列腺素内过氧化物合酶(PTGS2)。NOS1是一氧化氮合酶3种亚型之一，也是炎症的重要介质之一，研究结果表明，抑制NOS1可阻止AP1转录因子亚基的核异位，减弱炎症基因的转录进而抑制炎症反应[13]。CCL2是趋化因子中CC家族重要成员，也称为单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，PID患者血浆中MCP-1表达显著升高，血浆MCP-1浓度的评估可作为PID诊断的生物标志物[14]。此外，慢性非细菌性前列腺炎(chronic pelvic pain syndrome，CPPS)相关临床研究中发现，CPPS患者血浆中MCP-1水平明显高于健康人，MCP-1可作为CPPS诊断的生物标志物[15]。SOX9作为肿瘤坏死因子α(TNF-α)的下游靶标，在牙髓炎和免疫反应中发挥着重要作用[16]。PTGS2也称为环氧合酶2(COX2)，也是重要的炎症介质，而COX2衍生的前列腺素是慢性前列腺炎和CPPS的重要治病因素[17]。

图1 康妇炎胶囊治疗PID核心靶标网络图Fig 1 Network diagram of core targets of Kangfuyan capsules in the treatment of PID

2.3 康妇炎胶囊与PID核心靶标功能及通路分析

基于DAVID数据库中GO和KEGG对150个药物和疾病靶标进行功能和通路分析，对数据库中富集的P值由小至大排序居前20位的生物学过程进行深入分析，以生物学过程为纵坐标，以基因比率为横坐标构建气泡图，结果见图2(A)。这些核心靶标主要富集于ERK1和ERK2级联的正向调控(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、炎症反应(inflammatory response)、蛋白激酶B信号转导(protein kinase B signaling)以及脂多糖介导的信号通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)等生物学过程。

此外，同样对KEGG通路中P值由小到大排序居前20位的通路进行分析，以KEGG通路为纵坐标，以基因比率为横坐标构建气泡图，结果见图2(B)。可见，150个核心靶标主要富集于查加斯病(美国锥虫病)[Chagas disease (American trypanosomiasis)]、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、Rap1信号通路(Rap1 signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、趋化因子信号通路(Chemokine signaling pathway)以及T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)。

2.4 康妇炎胶囊治疗PID的多维网络分析

以KEGG通路富集分子中P值由小至大排序居前20位的通路制作中药-成分-靶标-通路多维网络分析，涉及11味药物的164个成分以及107个靶标，见图3。蒲公英中主要含有蒲公英甾醇、酚类和多糖类成分等，上述成分具有抗炎和抗菌作用，如蒲公英甾醇和蒲公英皂苷对脂多糖诱导的炎症有显著的抑制作用，其作用机制可能是通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核因子κB(NF-κB)通路发挥抗炎作用[18-20]。败酱草中富含黄酮、甾体、皂苷和鞣质等成分，其中白花败酱醇具有较强的抗炎作用[21]。白芍中的芍药苷可抑制炎症因子TNF-α、Il-1β和iNOS的分泌，降低IκB磷酸化，通过抑制NF-κB的核转位改善炎症[22]。当归中的当归挥发油能够改善LPS诱导炎症模型[23]。川芎中的洋川芎内酯、A,Z-藁本内酯、新蛇床内酯和Z-藁本内酯可能通过COX-2、细胞外调节蛋白激酶2(ERK2)、蛋白激酶C(PKC)、Janus激酶1(JAK1)、JAK2、JAK3及NF-кB抑制蛋白激酶β(IKKβ)、TNF-α，阻碍炎症信号传递[24]。香附中的Alpha-Cyperone同样能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子COX-2和IL-6，其作用机制可能通过调控NF-κB有关[25]。延胡索中的黄连碱、小檗碱、巴马汀、二氢血根碱和去氢紫堇碱可通过影响PI3K、JAK、PKC、ERK、IKKβ及TNF-α所在信号通路发挥抗炎作用[26]。泽泻中的泽泻总三萜具有良好的抗炎作用[27]。白花蛇舌草也是治疗PID的佳品[28]。康妇炎胶囊中11味药材所含的成分可能通过影响TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、趋化因子信号通路和T细胞受体信号通路等通路中的靶标IL-6、MAPK14、TNF、NF-κB1、PTGS2、CCL2及NOS3改善炎症反应。

A.GO功能富集分析；B.KEGG通路富集分析A.GO functional enrichment analysis;B.KEGG pathway enrichment analysis图2 康妇炎胶囊治疗PID关键靶标基因功能分析Fig 2 Gene function analysis on key targets of Kangfuyan capsules in the treatment of PID

图3 康妇炎胶囊“药材-成分-靶标-通路”网络图Fig 3 Network diagram of “herb-compounds-target-pathway”of Kangfuyan capsule

3 讨论

PID多因产后、剖宫产后、流产后以及妇科手术后细菌进入创面感染而致，近年来，多由下生殖道的性传播疾病(sexually transmitted diseases，STD)上行感染至上生殖道而造成。PID多数以疼痛为主要表现。目前，单用抗菌药物治疗的用药时间长，日后容易迁延，而配合清热解毒、理气活血的中药口服治疗，可提高PID的治愈率。此外，PID后遗症有组织破坏、粘连、增生及瘢痕。采用中医活血化瘀的方法治疗，有助于恢复破坏组织、松解粘连、缓解增生及瘢痕形成。中药复方制剂康妇炎胶囊具有清热解毒、化瘀行滞和除湿止带的功效，能够有效治疗PID和缓解PID后遗症。但其作用机制尚未阐明，本研究采用网络药理学方法，结合国内外专业数据平台和分析软件，分析了康妇炎胶囊治疗PID的潜在靶标，并对关键靶标进行了生物信息学分析，构建了康妇炎胶囊治疗PID的多维网络图。

康妇炎胶囊是由蒲公英、败酱草、薏苡仁及赤芍等11味中药组成，通过相关数据获得249种成分，上述成分潜在的靶标有1 594个，其中一些成分可能是康妇炎胶囊中的质量标志物，通过与相应靶标相结合发挥抗炎作用，从而改善PID及其后遗症[29]。PID疾病靶标收集结果显示，PID发病机制中94个靶标可能通过直接或间接作用影响PID的发生发展过程。中药的化学实体与生命体分子网络的交互作用是中药治疗疾病的重要方式[30]。在这些药物靶标和疾病靶标中，NOS1、CCL2、Sox9和PTGS2靶标是药物和疾病共有靶标，这4个靶标均为炎症的重要介质，在PID或炎症性疾病中发挥重要作用，因此，其可能在康妇炎胶囊治疗PID中发挥主导作用。进一步的生物信息学分析结果显示，药物和疾病组成的核心靶标参与了炎症反应、LPS介导的信号通路、ERK1和ERK2级联的正向调控、PI3K信号的正向调控等生物学过程，其中LPS通过识别细胞膜上的TLR4受体诱发炎症反应过程[31]。此外，这些核心靶标参与TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、趋化因子信号通路及T细胞受体信号通路等炎症信号通路，表明康妇炎胶囊可能通过干预上述通路中的核心靶标参与了PID及其后遗症的治疗。中药-成分-靶标-通路分析结果显示，康妇炎胶囊中的成分不仅可以通过影响NOS1、CCL2、Sox9和PTGS2靶标发挥药效，还可以通过干预TNF信号通路、趋化因子信号通路及T细胞受体信号通路等通路中的IL-6、MAPK14、TNF、NF-κB1及NOS3等靶标参与PID的治疗过程。

本研究通过网络药理学方法，建立了康妇炎胶囊中11味中药的中药-成分-靶标(药物和疾病)-通路网络，显示了中药多成分与靶标之间的关联，并且明确了康妇炎胶囊药效物质及其发挥治疗PID的分子机制，为康妇炎胶囊治疗PID及其后遗症提供了临床依据，也为进一步的体内外试验提供了重要参考。