李梦莹，田 帅，董玉惠，马小静，张淮瑜，宋阿北，周向梅，许立华

(1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021 ； 2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193)

蛋白组学技术串联质谱标记(Tandem mass tag，TMT)与液相色谱质谱联用(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)相结合是一种基于标记定量的新技术，可以对多个样品进行蛋白质和多肽的定量分析[1]。TMT是定量蛋白质组学中最常用的同位素标记方法，它对蛋白质的相对表达量提供了准确性和可重复性。该方法可对鉴定的蛋白质进行相互验证，为牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)的毒力蛋白以及致病性提供依据。

M.bovisC68004菌株是20世纪50年代从1头患有结核病的牛组织中分离得到，M.bovisN菌株是2015年从具有典型全身性结核病症状的犊牛大脑中分离出来。程广宇等对这2株细菌在小鼠模型上的致病性进行了研究，发现M.bovisN感染的小鼠肺部和脾脏的病变程度比M.bovisC68004感染的小鼠更为严重[2]。然而，仍然不清楚这2个菌株的毒力因子差异，以及它们在激发宿主免疫反应的不同是否与其蛋白表达差异有关。因此，本试验将2株牛分枝杆菌进行蛋白组学分析，找出差异表达蛋白，并分析这些差异蛋白对其致病性及毒力的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株M.bovis(菌株号:C68004菌和N菌)由中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养与制备 2株菌株均在添加10% OADC(油酸、牛血清蛋白V、右旋糖、过氧化氢酶)和1% Tween80的Middlebrook 7H9(BD Biosciences公司)液体培养基中培养。细菌OD值为0.6～0.8，3 000～5 000 g离心5～15 min，去上清，PBS洗涤沉淀3次，液氮速冻，菌体-80 ℃保存。

1.2.2 蛋白样品制备方法(匀浆裂解法[3]) 取菌体沉淀加入适量SDT裂解液，转移至预先装有适量石英砂(组织样品另外加入1颗1/4英寸陶瓷珠)的2 mL离心管中，用美国MP匀浆仪进行匀浆破碎(24 s×2，6.0 m/s，60 s，2次)。……