李 爽，张明君，杭程远，师瑜倩，杨 倩，杜 娟，张 强，梁福琴

(1.陕西省红枣重点实验室(延安大学)，陕西 延安 716000; 2.延安大学 生命科学学院，陕西 延安 716000;3.延安市农业科学研究所，陕西 延安 716000)

1 前言

大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines, Soybean cyst neamatode, SCN)分布于全球大豆主要产区，是大豆生产上重要的病原之一。大豆胞囊线虫引起的大豆胞囊线虫病一般造成大豆产量减少5%～50%，严重发病时可导致绝收[1]。在我国大豆胞囊线虫主要分布在东北和黄淮大豆主产区，并逐渐向贵州、甘肃和广西等省份蔓延[2～4],陕西地区大豆胞囊线虫调查研究尚未开展。

陕西省包括陕北、关中和陕南三个生态农业区，陕北地区以春播大豆为主，在耕作模式上采用玉米、谷子与大豆轮作，在关中地区主要实行豆麦轮作，以夏播大豆为主。陕西省大豆胞囊线虫线虫的分布、生理小种类型情况尚未调查。研究在大豆振兴计划政策指导下，在国家大豆产业体系延安试验站和陕西省豆类产业体系在落实中省政策和技术试验示范推广的背景下；大豆面积会有一定程度增加，这势必会扩大大豆胞囊线虫发生范围。一旦长期忽略大豆胞囊线虫病的蔓延，将造成病害大面积发生，严重危害陕西省的大豆生产。笔者研究为全面监测陕西省大豆胞囊线虫的分布与生理小种变化以及大豆胞囊线虫抗病育种提供理论参考。

2 材料与方法

2.1 试验点土样采集

分别于陕西省岐山县，陕西省富县，陕西省甘泉县，陕西省志丹县采集大豆田间土样。采用“Z”字法采集大豆根际5～15 cm的土壤样本200 g，每个地区采集30个点，将土壤样本按地区充分混合后标记，用于后续大豆胞囊线虫形态鉴定、生理小种鉴定[5]。

2.2 试验材料与仪器

研究中，供试大豆材料共两部分，第一部分是大豆胞囊线虫鉴别寄主，即PI88788、PI90763、Pickett、Peking和Lee74，其中Lee74为感病品种。荧光素二乙酸盐(Sigma-Aldrich，日本)、丙酮、蒸馏水、品红、冰醋酸、甘油、浓盐酸、次氯酸钠、0.2%水琼脂。

2.3 研究方法

2.3.1 大豆胞囊线虫形态学鉴定 从各地土样中挑去颗粒饱满体表完整的胞囊，参考冯志新的方法在解剖镜下用解剖刀切下阴门锥，转移到40% H202中漂白处理4 min[6]。依次转移至70%、95%和100%乙醇中脱水，制成玻片。鉴定线虫种类。

2.3.2 大豆胞囊线虫小种鉴定法 2019年4月末至6月中旬，在延安市农业科学研究所温室内将采集到的病田土参入灭菌沙土，混合均匀后转入15 cm×15 cm的黑色营养钵，每盆播种鉴别寄主3粒种子，全部试验重复5次，定期浇水；30 d后拔出鉴别寄主根系，调查根系胞囊数量。大豆胞囊线虫生理小种鉴别方法按照Riggs发表的方法进行[7]。大豆胞囊鉴别寄主为沈阳农业大学植物保护学院北方线虫研究所段玉玺教授提供。试验中采用Golden等使用的鉴别寄主PI88788、Peking、PI90763、Pickett和Lee五个品种；其中Lee为大豆胞囊线虫感病对照。雌虫指数(FI，Female Index)计算公式如下[8]：

雌虫指数(FI)=

若FI≥10为感病，反之，FI≤10则为抗病。

2.3.3 大豆胞囊线虫染色 实验中大豆胞囊线虫染色方法包括两种，第一种是传统的次氯酸钠—酸性品红染色法，第二种是荧光素二乙酸盐染色法。次氯酸钠—酸性品红染色法按照Byrd和刘维志所描述的方法，根据根系发育的不同时间适当调整甘油脱色的时间[1, 9]。大豆胞囊线虫侵染后的大豆根系经历漂白—染色—脱色的三个关键步骤后在体视显微镜下观察。

荧光素二乙酸盐染色法是利用荧光素二乙酸盐(Fluorescein diacetate, FDA)进入细胞后被内源性酯酶水解后变成荧光的原理标记大豆胞囊线虫[10, 11]。最初FDA标记线虫主要是通过荧光形态区别线虫是否死亡。首先，FDA溶于丙酮制备成的母液(5 mg·mL-1)，加入无菌水制备成1%FDA的染料溶液，在大豆胞囊线虫孵化至二龄幼虫后，浸泡在1%FDA的溶液中，置于黑暗的条件下室温浸泡线虫6 h以上；标记的大豆胞囊线虫接种前，无菌水冲洗3次，去除线虫体壁的FDA溶液，将冲洗完毕的二龄幼虫混入200 mL 0.2%水琼脂制成100条·mL-1的线虫接种混合液，在大豆根系附近接种，5 d后开始取样检测，检测时在荧光显微镜下观察，为防止根系水分蒸发，在观察时在根系覆盖适量甘油。

表1 大豆胞囊线虫生理小种分类系统

3 结果

3.1 大豆胞囊线虫形态学鉴定结果

陕北和关中地区分离到的胞囊呈梨型或柠檬型，体表颜色浅褐色至深褐色，阴门锥下发有明显的长型泡状突起，双半膜孔，双膜孔间有发育良好的下桥，阴门膜孔长度，从形态学鉴定其为大豆胞囊线虫。

3.2 大豆胞囊线虫生理小种鉴定

在陕西甘泉、富县、志丹和岐山四个地区采用田间法鉴定大豆胞囊线虫生理小种类型，每个地区10次重复。鉴定结果表明四个地区的测试结果表明陕北和关中地区所检测的大豆胞囊线虫为3号生理小种(表2)。

表2 陕西地区大豆胞囊线虫生理小种鉴定

3.3 荧光素二乙酸盐代替次氯酸钠—酸性品红染色检测大豆胞囊线虫发育

在大豆胞囊线虫3号生理小种侵染感病品种Lee74的5、10和15 d后，利用次氯酸钠—酸性品红染色法对Lee根系中的大豆胞囊染色。被品红染色的线虫成红色，在侵染5 d后呈细线状；侵染10 d后大豆胞囊线虫发育至三龄幼虫；侵染15 d后大豆胞囊线虫发育至四龄幼虫，虫体部分撑开根系表皮暴露在外。利用FDA标记法观察接种大豆胞囊线虫5 d后的根系，在红色箭头标记处的线条状就是在荧光显微镜下根系中线虫的形态，FDA标记的线虫在紫外光选线下亦可以观察到。FDA标记法样本处理环节简单，在样本可以重复观察使用，FDA标记的线虫至多可观察10 d，在此期间可随时掌握大豆胞囊线虫发育的情况，此外，FDA标记法可以相对准确定位胞囊线虫及合胞体的位置，便于组织病理学切片的制备，提高实验效率。

4 讨论

大豆胞囊线虫是一种顽固的植物根系寄生线虫，严重危害我国乃至全球的大豆生产，大豆胞囊线虫在我国从北至南，由东到西的大豆产区均有不同程度的发生。大豆是陕北地区主要的杂粮作物，其结瘤固氮的功能是陕北地区养地轮作改善土壤有机质含量的重要作物之一。

研究通过形态学鉴定陕西省陕北地区为主结合宝鸡岐山地区的胞囊线虫为大豆胞囊线虫；且生理小种为3号。次氯酸钠—酸性品红染色技术是检测植物根系内寄生线虫理想的方法之一，该方法使根系内线虫着色，而根系不着色。通过体视显微镜可以清楚地显示根系内寄生线虫的数量、位置以及发育状态。相比较次氯酸钠—酸性品红染色方法对样品造成不可逆的破坏，利用荧光素二乙酸盐标记大豆胞囊线虫，可以在活体植株上观察大豆胞囊线虫侵染的状态，样本可以重复利用。此外，利用FDA标记线虫可以准确定为线虫诱导取食位点的位置，便于组织学研究样本的制备。但FDA标记也存在一定的局限性；FDA进入细胞后被内源性酯酶水解后变成荧光大约停留10 d左右，此后荧光随大豆根系生长逐渐难以检测。所以该方法适用于在植物寄生线虫等其他寄生性病原物前期侵染的研究。

在“大豆振兴计划”的政策指引下和陕西省豆类产业体系的推广下，陕西省大豆面积会有一定程度的增加，必然也扩大了大豆胞囊线虫发病范围。一方面，在接下来的工作，持续对陕西省全域的大豆产区进行调查，掌握全省大豆胞囊线虫的生理小种分布，达到动态监测全省生理小种及其变化趋势的目的。另一方面，更重要的是通过陕西省全域大豆胞囊线虫分布以及生理小种的调查和陕西省大豆种质资源抗性鉴定能明确陕西省大豆胞囊线虫发生以及综合防治以及陕西省大豆胞囊线虫抗病育种工作提供一定的理论参考。