程维金 罗治建 陈亮 丁强 张叔勇

摘 要： 采用松材线虫的核糖体DNA的内转录区序列及cathepsin L-like cysteine proteinase为目的片段设计2对引物，建立了可特异性检测松材线虫的双基因PCR检测法。利用这2对引物，松材线虫可扩增出大小分别为490 bp及264 bp的产物，而其他对照组均无扩增。此检测方法经过实际应用检验，灵敏度与常规PCR一致，而特异性更高，可以应用于实验室的常规检测需求。

关键词： 松材线虫;双基因PCR;检测方法

中图分类号：S43   文献标识码：A   文章编号：1004-3020（2021）02-0060-04

Establishment of Two Gene-jointed PCR Detection Assay for

Bursaphelenchus xylophilus

Chen Weijin（1） Luo Zhijian（2） Chen Liang（2） Ding Qiang（3） Zhang Shuyong（4）

（1.Wuhan Forestry Station Wuhan 430023;2.Hubei Provincial General Station of Forest Pest Control and Quarantine Wuhan 430079;3.Wuhan Baolvfeng Biotechnology Co.Ltd. Wuhan 430048;4.Wuhan Institute of Virology，CAS Wuhan 430071）

Abstract： In this paper，a new two gene-jointed PCR detection assay to detect Bursaphelenchus xylophilus，was established.For developing the two gene-jointed PCR detection of B.xylophilus，two pairs of primers were designed according to sequence of B.xylophilus available in GenBank，targeting the cathepsin L-like cysteine proteinase gene and ribosomal DNA internal transcribed spacer region.The specificity，sensitivity assay and clinical samples were tested by using the optimized reaction system.Results showed that the specific fragments 490 bp and 264 bp were able to amplified，while there was no amplification product found in positive controls and other tested ones.The method was applied to detect clinical samples and the result showed 100 % consistence with PCR.These results could be served as a basis detection application in diagnosis of B.xylophilus.

Key words： Bursaphelenchus xylophilus;two gene-jointed PCR;detection

松材线虫病（Pinewilt disease）是危害松属植物的一种毁灭性病害，以松树萎蔫病为典型症状，具有发病致死速度快、传播蔓延迅速、防治难度大等特点[1]。该病由松材线虫Bursaphelenchus xylophilus引起，该病主要通过人为调运带疫的苗木、松木制品等进行远距离传播，目前最主要的防治措施是通过设立和建设无病区，加强植物检疫，严防病原传入。其中，加强松材线虫的早期诊断和检测技术的研究尤为重要。

双基因联合PCR扩增是一种特殊的多重PCR扩增技术[2]。该检测技术主要选定两个不同的靶基因分别进行特异性引物的设计，然后同时利用两对特异引物对反应体系进行优化、扩增，从而建立起两个互不干预的检测体系。双基因联合PCR擴增与常规PCR检测技术相比，2个基因的检测结果可以相互印证，有效减少了假阳性和假阴性结果的出现，具有更高的准确性。

本试验根据松材线虫的核糖体DNA的内转录区序列及基因组cathepsin L-like cysteine proteinase基因的特定区域进行两对特异性引物的设计，并成功建立了松材线虫双基因联合快速检测体系，此检测方法经过实际应用检验，灵敏度与常规PCR一致，而特异性更高，可以应用于实验室的常规检测。……