生物检材中常见除草剂的分析方法及研究进展

2021-06-17岳琳娜向平宋粉云严慧

法医学杂志 2021年2期

岳琳娜，向平，宋粉云，严慧

1.司法鉴定科学研究院上海市法医学重点实验室司法部司法鉴定重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.广东药科大学药学院，广东广州510006

除草剂又称除莠剂，被广泛应用于各种作物的杂草防治已经有近80 年历史，目前我国常见的除草剂包括季铵盐、酰胺、有机磷、苯氧羧酸等10 余种类型[1]。在显著提高粮食产量的同时，大量使用除草剂可造成环境污染和生态破坏的恶劣后果，对人类健康产生严重影响，威胁全球公共卫生安全，由误服、投毒、自杀等引起的除草剂中毒案件也随之增多。引起中毒的除草剂主要有百草枯（paraquat，PQ）、敌草快（diquat，DQ）、草甘膦（glyphosate，GLY）和草铵膦（glufosinate，GLUF）等。

目前，文献报道的生物检材中除草剂的检测方法主要是针对百草枯、敌草快、草铵膦和草甘膦等，对其他除草剂分析主要是在土壤、农田、水及农作物等非生物检材中进行。本文通过对生物检材中百草枯、草甘膦和其他常见除草剂的分析方法的研究进展进行综述，总结中毒案例数据，为体内生物检材中除草剂快速准确的定性筛选和定量分析提供参考，也为临床诊治和法庭科学案件鉴定提供技术支持。

1 常见除草剂中毒

百草枯的化学名称是1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，是一种快速灭生性除草剂，具有触杀作用和一定的内吸作用。敌草快的化学名称是1，1’-亚乙基-2，2’-联吡啶二溴盐，是一种传导性触杀型灭生性除草剂，可迅速被绿色植物组织吸收，与土壤接触后很快失去活性。百草枯和敌草快同属于季铵盐类化合物，都具有强极性、易溶于水、以阳离子形式存在、微溶于有机溶剂、难挥发等特性。百草枯对人和动物的毒性远远大于其他除草剂，且无特效解毒药，摄入20%百草枯水溶液5～15 mL 就会致人死亡[2]，血浆和尿液中的百草枯质量浓度在24 h 内分别大于3 mg/L和1 mg/L 时，患者的生存率非常低[3-4]。研究[5-7]结果表明，百草枯和敌草快可经胃肠道、呼吸道、皮肤、黏膜等吸收，但因其无挥发性和非脂溶性，经消化道（自服或误服）吸收中毒是主要途径。百草枯口服中毒死亡率可达90%以上[8]，目前已被包括我国在内的20 多个国家禁止或者严格限制使用。百草枯中毒早期可导致消化道、肺、肝、肾等重要器官损害，其中以肺损伤最为明显，重症患者多死于呼吸衰竭或多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[2]。大鼠口服百草枯的LD50为157 mg/kg，人体内百草枯的LD50大约为35 mg/kg[4，9]。经口摄入敌草快时，人及动物的毒性表现为：初期引起口腔、食道等消化系统的糜烂、溃疡，被机体吸收后对肝、肾等高血流器官具有很强的毒性，引起多器官功能不全，产生严重的中枢神经系统毒性作用，可致突然死亡[10-11]。大鼠口服敌草快的LD50为231～400 mg/kg，兔口服敌草快的LD50为101～190 mg/kg[12]。尽管受到严格限制，百草枯中毒仍然是急性中毒患者死亡的主要原因之一。据报道，每年在亚洲、美洲、欧洲都有大量百草枯中毒死亡案例出现[13]，百草枯中毒一直是研究的热点和难点。

草甘膦和草铵膦为有机磷类化合物。草甘膦除草剂有草甘膦铵盐和草甘膦异丙铵盐，市售草甘膦多为草甘膦异丙铵盐，因其具有广谱、高效、低毒等优点而被广泛应用。草铵膦可以有效去除绝大部分耐草甘膦杂草，且具有低毒、活性高和环境相容性好等特点因而受到青睐，是目前用量仅次于草甘膦的世界第二大转基因作物耐受除草剂[14]。草铵膦、草甘膦及其在人体内的主要代谢产物氨甲基膦酸（aminomethyl phosphonic acid，AMPA）的化学结构相似，都具有较强的极性和两性离子结构，难挥发，水溶性高，极难溶于有机溶剂，且分子结构中无紫外吸收基团。草甘膦、草铵膦作为百草枯的替代品，尽管被认为是一种低毒除草剂，但发生中毒后，致死率也可达20%～30%[15]。草甘膦急性中毒基本是经口误服所致，国内外均有较多经口误服中毒的报道[16]。有研究[17-18]表明，大量摄入草甘膦会导致严重的呼吸系统疾病、意识改变、低血压、代谢性酸中毒、胃肠问题和肾功能衰竭等。在韩国，每年约有1 000 人摄入草甘膦，越来越多的人试图通过服用草甘膦、草铵膦自杀[19]。虽然没有草甘膦对人体致死剂量的报道，但大鼠口服草甘膦的LD50为5 600 mg/kg，有4 名故意摄入过量草甘膦的成年人的死后血液质量浓度为68.8～1 936 mg/L[19]。

到目前为止，许多研究表明血浆和尿液中百草枯浓度是评价百草枯中毒严重程度最常用的指标[3，20]。如毒物接触史不详，即使临床表现不典型，但血液、尿液中检出百草枯，诊断也依然成立。草甘膦进入体内后绝大部分以原形经尿液排出体外，检测尿液中草甘膦能够反映患者的中毒或接触情况[21]。在除草剂急性中毒的情况下，检测人体血液和尿液中是否存在除草剂可以提供重要信息以确定毒物种类、吸收剂量以及对人体组织的毒害程度，这不仅对评估患者的生存率和预后有重要意义，对临床诊断也有重要价值，在法医学鉴定实践中也有助于查明死因。

2 检测方法

2.1 样品前处理

2.1.1 蛋白沉淀法

针对样品前处理，约70%的文献均采用乙腈一步法沉淀蛋白。LU 等[22]为了提高血浆和尿液中百草枯的萃取和净化效率，对沉淀剂乙腈是检材的两倍量和三倍量进行比较，结果表明，三倍量乙腈沉淀蛋白效果更好，血浆萃取回收率为79.90%，尿液萃取回收率为90.22%。该方法操作简单、快速，适合于脂溶性小、极性大的化合物从蛋白结合状态中释放出来。但此法沉淀蛋白的效果较差，通常需要1～3 倍体积的乙腈才能使得90%以上的蛋白质沉淀，同时稀释了样品，降低了灵敏度。由于乙腈与水相溶，故不能解决样品的分离净化问题，干扰成分相对较多。有研究[20，23-24]用乙腈-无水硫酸钠、乙腈-0.1%甲酸、三氯乙酸-甲醇等混合溶剂沉淀蛋白，选择将有机溶剂和盐、酸溶液等并用进行萃取，使蛋白质脱水、形成不溶性盐而沉淀，提高化合物的回收率，是较为理想的一种前处理方法。

2.1.2 提取纯化法

生物样品中除草剂的提取纯化方法主要有液-液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）和固相萃取法（solid phase extraction，SPE）。与液-液萃取法相比，固相萃取法具有选择性强、有机溶剂消耗少、吸附剂选择灵活、富集系数高等优点。近年来，固相萃取技术被越来越多地用于预富集和分离超痕量的无机和有机化合物，基于不同吸附剂的固相萃取技术因其富集和净化效果优越，已被广泛应用于生物样品中除草剂的样品前处理。

对于草铵膦、草甘膦和AMPA，在常用的C18、HLB等吸附剂中很难获得高效的富集和清除效率，寻找合适、有效的固体吸附剂用于固相萃取是一个值得关注的问题。WATANABE 等[25]报道了一种基于二氧化锆包裹的二氧化硅柱与含磷氨基酸类除草剂特异性相互作用的固相萃取法，将原乙酸三甲酯作为衍生试剂，快速萃取血清和尿液中草甘膦、草铵膦和双丙氨膦（bialaphos），结果表明，草甘膦总回收率大于60%，草铵膦和双丙氨膦总回收率大于80%。CHEN 等[26]选择了将冷诱导相分离（cold-induced phase separation，CIPS）与亲水性移液管顶端固相萃取（hydrophilic pipette tip solid phase extraction，PTSPE）相结合的方法提取尿液中草甘膦和AMPA。首先，尿液样本用乙腈（V尿液∶V乙腈=20∶80）沉淀蛋白质，离心后，在-20 ℃下进行CIPS，草甘膦和AMPA 达到了6 倍富集，结合亲水性手动移液管对草甘膦和AMPA 进行提取，采用氨基修饰的二氧化硅亲水性吸附剂吸附草甘膦和AMPA。结果显示，草甘膦和AMPA 绝对回收率分别为（87.2±1.7）%和（89.8±3.3）%，实现了尿液中草甘膦和AMPA 的高效富集、高效萃取。由于草铵膦、草甘膦和AMPA 具有强极性和两性离子结构，DINISOLIVEIRA 等[13]采用阴离子交换柱分离血液样本中草甘膦和AMPA，成功去除蛋白质、脂类等大分子干扰，草甘膦和AMPA 的回收率为82.3%～89.1%。阴离子或阳离子交换柱相较于普通固相萃取柱更适用于高极性、可电离样品的处理，且具有样本量小、萃取回收率高、重现性好等优点。GUO 等[27]采用改进的极性农药快速分析法，结合PRiME HLB 色谱柱，进行血液中草甘膦、草铵膦、双丙氨膦及代谢物的提取净化，回收率可达到82.6%～89.9%。该方法可对多种来源的高极性目标分析物进行酸化甲醇萃取和过滤，样品不用衍生化，萃取物通常可直接进行检测分析。还有学者[22]选择亲水作用液相色谱柱以解决高极性物质难保留和难分离的问题。

百草枯属于阳离子化合物，易溶于水，难溶于有机溶剂。RAHIMI 等[28]采用以离子对交换亲水性溶剂为基础的均相液液微萃取技术，提取尿液和血浆中百草枯。三乙胺水溶液为亲水性交换溶剂，十二烷基硫酸钠为离子偶联剂，二氧化碳调节溶液pH。将百草枯与十二烷基硫酸钠形成的离子络合物萃取到三乙胺中，样品提取在3 min 内可完成，富集因子达到74，回收率为90.0%～92.3%。SHA 等[29]采用磁性固相萃取法纯化血液和尿液中的百草枯，以Fe3O4@SiO2纳米颗粒为磁性固相萃取剂，用氢氧化钠和抗坏血酸洗脱Fe3O4@SiO2纳米颗粒吸附的百草枯，百草枯达到了35 倍浓缩。KUMARI 等[30]提出了一种新的萃取技术——旋转搅拌单滴微萃取法，用于组织样品中百草枯分离。结果表明，百草枯平均回收率大于91.21%，富集因子高达114。还有学者[31]提出采用干血斑（dried blood spot，DBS）法萃取血液中百草枯，用流动相直接超声10 min 提取百草枯效率最高。结果表明，干血斑干燥度越高，百草枯回收率就越高，选择微波辐射加快干燥过程，可将干血斑的制备时间缩短至5 min，并且微波照射不会引起百草枯的降解，检出限可达到0.5 ng/mL。干血斑法相对于液-液萃取法、固相萃取法或直接沉淀蛋白法而言，其主要优点在于样品前处理非常简单，样品取样量更少，溶剂用量小，百草枯贮藏在干血斑中稳定性好，室温下未见明显降解，检出限更低，分析时间更短等。

ALADAGHLO 等[32]用溶剂辅助分散固相萃取法（solvent-assisted dispersive solid phase extraction，SADSPE）处理尿液，将极少量吸附剂二苯甲酮分散于样本中进行痕量待测成分丁草胺的分离，富集因子达到174.2。固相萃取法与沉淀蛋白法相比，虽然操作步骤较多，但提取回收率较高，适合对微量样品的处理。

2.2 仪器分析

气相色谱法（gas chromatography，GC）不适用于挥发性差、热稳定性差或离子型等化合物的检测，百草枯、草甘膦和草铵膦不适合直接利用GC 进行分析，通常需要对样品溶液进行衍生化处理，衍生化虽然能提高检测的灵敏度，并能对其代谢物同时进行测定，但衍生化处理过程复杂、分析时间长、方法重现性差。高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）具有灵敏度高、分析速度快等特点[33]，较气相色谱-质谱联用法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）和液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）检测成本更低，但难以满足灵敏度的要求。LC-MS/MS 有更高的灵敏度和检出能力，是最常用的定性和定量检测方法。随着高分辨质谱（high resolution mass spectrometry，HRMS）技术的日益成熟，结合超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）使用，为生物样品中痕量除草剂的快速准确分析提供了有效的解决方案。有学者[34]报道了一种几乎不需要对血清样本进行前处理，不需要繁琐的纯化、分离过程，无需衍生化，检测中几乎没有观察到基质干扰的探针电喷雾电离-串联质谱法（probe electrospray ionization-tandem mass spectrometry，PESI-MS/MS），可在0.3 min 内完成人血清中草甘膦和草铵膦的定量分析。

3 中毒案例及相关研究

3.1 除草剂中毒案例结果汇总

对6 类9 种常见除草剂［联吡啶类：百草枯；有机磷类：草铵膦，草甘膦；三氮苯类：莠去津，溴草腈；酰胺类：乙草胺；苯氧羧酸类：2-甲基-4-氯苯氧乙酸（2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid，MCPA），2，3，7，8-四氯二苯并二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzop-dioxin，TCDD）；杂环类：灭草松］中毒者体内检测结果进行汇总，结果见表1。

表1 生物样本中检出除草剂的种类、含量及检测方法Tab.1 Concentration of herbicides detected in biological samples and the detection method

3.2 除草剂的体内代谢研究

除了对人体内除草剂原体的测定，还有学者进行了除草剂体内代谢组学研究。WAN 等[42]采用基于GC-MS/LC-MS 的代谢组学方法评价百草枯中毒后血浆中氨基酸代谢物的变化及其潜在的预后价值。该研究共纳入40 例百草枯中毒患者，其中16 例存活，24 例死亡。研究发现，死者血浆中有25 个氨基酸水平异常表达，其中肌酸酐、吲哚乳酸、3-（4-羟基苯基）乳酸与百草枯死亡预测高度相关，死亡组这3 种氨基酸代谢物的水平明显高于存活组，3-（4-羟基苯基）乳酸盐曲线下面积（area under the curve，AUC）最高，为0.84，吲哚乳酸和肌酸酐AUC 分别为0.75 和0.83，提示可以用其来预测临床结果，作为判断百草枯中毒早期预后的有效指标。WANG 等[50]建立了一种基于GC-MS 的血清代谢组学方法评估急性百草枯中毒对大鼠的影响。将38 只雄性SD 大鼠随机分为对照组（n=19）和急性百草枯中毒组（n=19，百草枯注射剂量为36 mg/kg），分别于第2、3、4、5、6、7、8、15、21 d 收集两组大鼠的血清样本。与对照组相比，中毒组大鼠硬脂酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和甘油水平升高，D-半乳糖水平下降。WEN 等[37]采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）进行代谢组学研究，研究仅涉及血清百草枯质量浓度＞1 000 ng/mL 并接受血液灌流（hemoperfusion，HP）治疗的患者。百草枯中毒患者第一次百草枯血清质量浓度（第一次HP 前）为2 244～41 055 ng/mL，第二次百草枯质量浓度（第一次HP 后）为343～137 788 ng/mL，最后一次百草枯质量浓度（最后一次HP 后）均＜200 ng/mL。筛选出百草枯中毒死亡的关键代谢物是腺苷。第一次HP 处理后，虽然百草枯质量浓度明显降低，但腺苷水平仍未升高，最重要的是，在HP 处理2～3 d 后，百草枯几乎从血液中清除，但腺苷仍然维持在低水平。HONG 等[20]对急性百草枯中毒患者的血药浓度进行监测，探究血浆百草枯浓度与肝肾功能及凝血功能的关系。相关分析结果显示，百草枯浓度与肝肾血液指标［总胆红素（total bilirubin，TBIL）、直接胆红素（direct bilirubin，DBIL）、间接胆红素（indirect bilirubin，IBIL）、丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）、ALT/AST、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）］及凝血功能指标［凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶原活性（prothrombin activity，PTA）、国际标准化比值（international normalized ratio，INR）］高度相关，说明血浆百草枯水平与肝肾功能、凝血功能相关。

CHEN 等[51]观察大鼠血清中2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-dichlorophenoxyacetic acid；2，4-D）质量浓度随时间的变化及其药代动力学特征。将16 只大鼠分为A、B 两组（每组8 只，雄雌各半），分别灌胃2，4-D 300 mg/kg（A 组）和60 mg/kg（B 组），给药后5、15、30 min，1、2、4、8、24、48、72、168 h 间隔采集血样0.3 mL。168 h 时B 组雌鼠血清2，4-D 质量浓度低于最低定量限（lower limit of quantification，LLOQ；0.3 μg/mL）。A 组8 h 时雌鼠和雄鼠体内2，4-D 质量浓度最高平均值分别为612.3 mg/L 和520.1 mg/L。B 组2 h 时雌鼠2，4-D 质量浓度达到最高平均值223.8 mg/L，4 h 时雄鼠2，4-D 质量浓度达到最高平均值198.9 mg/L。B 组雄鼠168 h 时未检测到2，4-D。雌鼠与雄鼠的差异发生在A 组5 min，2、72 h 以及B 组5、15 min，1、72 h。A 组在72 h 时雄鼠和雌鼠差异最大（几乎是10 倍）。雄性大鼠血清中2，4-D 的清除速度明显快于雌性大鼠。