姜垚如，牛蕾蕾，冯娜，范浩亮，靳茜茜，杜秋香，曹洁，王英元，孙俊红

1.山西医科大学法医学院，山西 太原 030001；2.南方医科大学法医学院，广东 广州 510515；3.海南医学院基础医学与生命科学学院，海南 海口571199

肺栓塞（pulmonary embolism，PE）发病急、病死率高，严重威胁人类的健康与生命，通常继发于下肢深静脉血栓（lower extremity deep venous thrombosis，LEDVT）[1-2]。随着下肢深静脉血栓发病率的逐年上升，肺栓塞在法医学鉴定中的出现率也呈逐年增高趋势[3-4]。在法医学鉴定中，深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）的检验、相关死亡原因及因果关系的鉴定已成为法医病理学领域关注的热点和难点问题[5-6]。有文献[7-8]报道，下肢深静脉血栓的遗传率为0.11～0.83，提示遗传因素在下肢深静脉血栓发病过程中至关重要。本研究拟选取下肢深静脉血栓患者及健康对照者为研究对象，通过查阅国内外文献[9-12]，选取4 个凝血相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）基因位点［rs1799963（凝血因子V 基因Leiden）、rs6025（凝血酶原基因G20210A）、rs1042579（血栓调节蛋白基因c.1418C＞T）及rs1801131（亚甲基四氢叶酸还原酶基因）］，检测其突变情况，结合年龄、性别及其他血液生物化学指标研究下肢深静脉血栓的危险因素，以期为深静脉血栓形成的诊断提供分子遗传学的评价指标，也为肺栓塞的法医病理学鉴定及死亡原因分析提供新的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2014 年11 月—2015 年11 月在山西省人民医院和山西医科大学第二附属医院通过血管造影或多普勒确诊下肢深静脉血栓形成的病例作为病例组，共150 例，其中男性83 例、女性67 例，平均年龄（55.33±14.67）岁。

收集对照组153 例，其中男性137 例、女性16 例，平均年龄（41.76±9.37）岁，均来自山西大同煤业集团健康员工。排除标准：既往无血栓栓塞症、心脑血管病史、血液系统疾病、重要生命器官疾病及外伤史等。

参与本研究的303 名对象均为山西籍汉族，血样采集的同时收集血常规、血液生物化学检验结果，记录D-二聚体、纤维蛋白原、纤维蛋白原降解产物、同型半胱氨酸、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白8 项临床指标。本研究所有受试者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血液标本的采集和保存

常规禁食12 h 后采集外周静脉血5 mL 置于抗凝管中，于干冰中运送，取回实验室后将血液标本分装于1.5mL离心管中，4℃冰箱中保存，1周内提取DNA。

1.2.2 DNA的提取及浓度测定

根据QIAamp®DNA Mini and Blood Mini 试剂盒（德国Qiagen 公司）操作说明书提取病例组及对照组的DNA。采用Infinite M200 PRO NanoQuant 酶标仪（瑞士Tecan公司）对所有样本的DNA进行浓度和纯度测定，D260/D280值均达到1.6～1.8，方可进行后续实验[13]。

1.2.3 基因型测定

由Invitrogen 公司对rs1799963（凝血因子V 基因Leiden）、rs6025（凝血酶原基因G20210A）、rs1042579（血栓调节蛋白基因c.1418C＞T）及rs1801131（亚甲基四氢叶酸还原酶基因）4 个位点进行引物合成，引物序列见表1。

表1 rs1799963、rs6025、rs1042579和rs1801131的引物序列Tab.1 Primer sequence of rs1799963，rs6025，rs1042579 and rs1801131

建立竞争性等位基因特异性聚合酶链反应（kompetitive allele specific polymerase chain reaction，KASP）10 μL PCR 反应体系[14]，体系构成如下：KASP master mix 5 μL、KASP primer mix 0.54 μL，样品质量浓度在反应体系需达到5 g/L，用ddH2O 将体系补足至10 μL。PCR 反应在HydrocyclerTM水浴PCR 仪（英国LGC 公司）中进行，用FLUOstar Omega 多功能酶标仪（德国BMG Labtech 公司）进行孔板荧光检测。

1.3 统计学分析

基 于rs1799963、rs6025、rs1042579 和rs1801131各自的基因频率及文献[9-12]报道的比值比（odds ratio，OR），结合本研究的样本量，最终计算得到其各自的统计效力，依次为78.8%、87.2%、96.9%、87.4%，可进行后续分析。

采用SPSS 22.0 软件（美国IBM 公司）对数据进行分析。由于下肢深静脉血栓好发于40 岁以上人群[15]，故以40 岁为界将对照组和病例组划分为40 岁以下组和40 岁以上组。血液生物化学指标等资料首先进行正态性检验，服从正态分布的数据用均数±标准差（）表示，病例组与对照组均数之间的比较采用方差分析；不服从正态分布的数据用中位数±四分位距（M±QR）表示，并采用秩和检验进行两组之间的比较，再以临床参考值为界限，采用χ2检验进行两组之间的比较，检验水准α=0.05。运用Hardy-Weinberg 平衡定律检验样本的群体代表性。将病例组与对照组中差异具有统计学意义的血液生物化学指标、年龄、性别分别引入二元Logistic 回归方程，得到下肢深静脉血栓形成的独立危险因素，并在校正这些混杂因素后，按检验水准α=0.20，应用错误发现率（false discovery rate，FDR）方法进行多重比较，探讨各基因在不同遗传模式下（显性遗传、隐性遗传、共显性遗传和加性遗传4 种模式）[16]基因多态性与下肢深静脉血栓形成的关系。

2 结果

2.1 临床资料分析

D-二聚体、纤维蛋白原、纤维蛋白原降解产物、同型半胱氨酸、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白8 项指标均不服从正态分布，经Mann-WhitneyU检验后，除甘油三酯、高密度脂蛋白在两组间差异无统计学意义外，其余6 项指标在两组中差异均有统计学意义。对上述指标进行χ2检验，甘油三酯、高密度脂蛋白在两组间的差异仍无统计学意义，其余6 项指标差异均有统计学意义，临床资料信息见表2。

表2 病例组和对照组的临床资料信息Tab.2 Clinical information of the case group and the control group （M±QR）

2.2 基因多态性与下肢深静脉血栓形成的分析

2.2.1 凝血相关基因多态性检测结果

通过KASP 基因分型技术检测全部样本基因型，经χ2检验基因型分布频率，本研究所收集样本符合Hardy-Weinberg 平衡，说明样本具有一定的群体代表性。基因型分布频率见表3。

表3 病例组和对照组在4个SNP位点的基因型分布频率Tab.3 Genotype distribution frequency of 4 SNP loci of the case group and the control group ［例（%）］

2.2.2 多因素二元Logistic回归分析

以是否患有下肢深静脉血栓作为因变量，以差异具有统计学意义的血液生物化学指标（D-二聚体、纤维蛋白原、纤维蛋白原降解产物、同型半胱氨酸、胆固醇、低密度脂蛋白）以及性别、年龄作为自变量分别引入二元Logistic 回归模型中，结果提示有5 个变量可能是下肢深静脉血栓形成的危险因素，结果如表4 所示。而其他血液生物化学指标在Logistic 回归模型中无意义，考虑可能与下肢深静脉血栓形成无明显相关性（P值均大于0.05）。

表4 Logistic回归分析结果Tab.4 Results of logistic regression analysis

2.2.3 遗传模式分析

对各基因在不同遗传模式下的基因多态性与下肢深静脉血栓形成之间的关系进行分析。在校正了性别、年龄、D-二聚体、纤维蛋白原降解产物、同型半胱氨酸等因素后，发现rs1042579 的基因多态性在显性遗传模式下发挥作用，与下肢深静脉血栓形成具有相关性：显性遗传模式下，rs1042579 的优势比为4.760，95%CI为1.457～15.550，P值 为0.010。rs1801131、rs1799963 在4 种遗传模式下均未发现与下肢深静脉血栓形成存在显著相关性（P＞0.20）。由于rs6025 在病例组及对照组中仅存在野生型CC 基因型，故主要对rs1042579、rs1801131 以及rs1799963 进行分析，3 种基因的遗传模式对下肢深静脉血栓的影响结果如表5 所示。

表5 3种基因在研究人群中的基因型遗传模式Tab.5 Genotype inheritance patterns of 3 genes in research population

3 讨论

静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism，VTE）是一种发病急、致死率高的血管病，主要分为静脉血栓形成和肺栓塞两种类型，据文献[17]报道，肺栓塞中约90%以上的栓子来自下肢深静脉。据统计[18-19]，血栓栓塞致死约占法医病理学鉴定案例死亡原因的5%。随着法医病理学检验技术的不断发展，肺动脉主干的栓塞以及微小血栓造成大面积肺梗死引起的死亡一般较容易鉴别，但对于涉及外伤、自身遗传因素在深静脉血栓形成中的因果关系鉴定仍然是实际工作中的重点和难点。

下肢深静脉血栓形成是指血液在深静脉血管内不正常凝结，阻塞管腔，导致静脉回流障碍，其发病机制目前普遍认同的是Virchow 的“三联征”，即血流动力学变化、血管壁的损伤以及血液成分的改变[20]。年龄、性别、肥胖、创伤、妊娠、恶性肿瘤等因素通常为外在诱因，基因突变导致的遗传性缺陷则是其形成的内在原因。随着研究的深入，凝血因子V 基因Leiden、亚甲基四氢叶酸还原酶基因、凝血酶原基因G20210A及血栓调节蛋白基因c.1418C＞T 的多态性与深静脉血栓形成之间关系的研究已被国内外学者探究报道[9-12，21-26]，凝血相关基因的多态性与下肢深静脉血栓的关系备受关注，因此，本研究基于山西人群，选取了上述4 种凝血相关基因进行研究。

rs1042579 突变使血栓蛋白调节基因编码的丙氨酸被缬氨酸取代，血栓调节蛋白无法发挥其应有的功能从而导致深静脉血栓形成。按照SNP 与疾病遗传关联性研究中对遗传模型的分析方法[27]，本研究分别对基因在显性、隐性、共显性、加性遗传模式下对下肢深静脉血栓形成风险进行了计算，结果表明，rs1042579 突变在显性遗传模式下可能是引起下肢深静脉血栓形成的独立风险因素。

rs6025 突变，G20210A 编码氨基酸的改变使凝血酶原异常增多导致血栓形成。对rs6025 突变的研究[9，23]结果显示，其在深静脉血栓形成患者中出现的频率明显高于正常人群，而本研究中无rs6025 突变个体，可能其并不是下肢深静脉血栓形成的危险因素，这与国内学者研究[25]结果一致。

rs1799963 突变使凝血因子V 基因Leiden 编码的氨基酸改变，无法与活化蛋白C 结合，仍保持促凝血的活性。在本研究中，rs1799963 突变例数为1 例，遗传模式的分析结果显示位点突变与下肢深静脉血栓形成无相关性，其不能作为下肢深静脉血栓形成的独立危险因素，考虑造成此种情况的原因可能与人种和地域差异有关。

rs1801131 突变使亚甲基四氢叶酸还原酶基因编码的氨基酸改变，致四氢叶酸还原酶的活性与热稳定性降低，亚甲基四氢叶酸还原酶的缺陷导致同型半胱氨酸在血液中堆积，引起血管舒缩平衡紊乱，从而引发血栓形成。有研究[12，28]提示，亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与深静脉血栓形成具有相关性，但本研究中rs1801131 突变在4 种遗传模式下均未显示出与下肢深静脉血栓形成相关，其可能不是下肢深静脉血栓形成的危险因素，分析该结果与国外学者研究结果不一致的原因，一方面可能是本研究样本量不足，样本代表性有差异，另一方面可能与不同国家或地域生活环境和地理条件差异以及种族间的遗传变异有关。

除此之外，本研究通过χ2检验，发现D-二聚体、纤维蛋白原、纤维蛋白原降解产物、同型半胱氨酸、胆固醇及低密度脂蛋白在两组中差异具有统计学意义，同时将年龄、性别引入二元Logistic 回归模型，最终确认D-二聚体、纤维蛋白原降解产物、同型半胱氨酸、年龄和性别可能为下肢深静脉血栓形成的独立危险因素。D-二聚体是纤溶过程的标志物，当机体存在高凝状态、血管内有活化的血栓形成和继发性纤维蛋白溶解亢进时，D-二聚体就会升高。纤维蛋白原降解产物能抑制纤维蛋白形成，有抗凝血酶作用，而升高的血浆同型半胱氨酸水平与深静脉血栓形成关系密切[29-30]。

本研究仍存在一些不足，由于对照组样本来自山西大同煤业集团健康员工，厂矿中女少男多，造成性别偏倚可能会对最终结果产生一定影响。因此，也将性别作为混杂因素列入多因素Logistic 回归模型中，分析其与下肢深静脉血栓形成的关系，在今后的研究中，将完善样本的收集并进一步探究。另外，基因多态性对下肢深静脉血栓患病率的影响存在地域、种族性差异，许多遗传变异与下肢深静脉血栓形成的相关性尚未完全清楚，且深静脉血栓形成可能涉及多个基因及多个位点，有时由于入选的研究对象存在地区和人种的差异，致基因多态性差异较大，研究结论也会不同。后续研究将不断扩大样本量，寻找更多与深静脉血栓形成有关的SNP 位点。凝血相关基因的研究、确定、检测对于临床防治和相关死亡原因的法医学鉴定具有深远意义，随着更多研究的深入进行，不仅对临床准确诊断并制定合理、有针对性的治疗方案有一定帮助，对法医学鉴定肺栓塞的发生及伤病关系鉴定也提供了新的思路和方法。