樊帅，吕广新，金媛媛，杨兆勇

·论著·

嗜热脂肪芽胞杆菌色氨酰-tRNA合成酶BsTrpRS的表达、纯化及其与创新霉素复合物的单晶制备和X-射线衍射分析

樊帅，吕广新，金媛媛，杨兆勇

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所微生物代谢工程室

获得来源于嗜热脂肪芽胞杆菌色氨酰-tRNA 合成酶（BsTrpRS）与创新霉素复合物的晶体结构，为创新霉素的理性设计提供结构基础。利用大肠杆菌表达系统异源表达获得 BsTrpRS 可溶性表达，采用亲和层析色谱、离子交换色谱和分子排阻色谱纯化目的蛋白，以期获得纯度在 90% 以上的 BsTrpRS，通过等温滴定量热法检测 BsTrpRS 与创新霉素的亲和力。选用悬滴-水蒸汽扩散法筛选蛋白质结晶条件，通过优化结晶条件获得高质量晶体，利用上海光源蛋白质晶体学光束线站收集 X-ray 衍射数据。运用分子生物学方法成功构建含基因的重组质粒，转化 BL21(DE3) 得到重组表达菌株。运用亲和层析、离子交换色谱和分子排阻色谱等蛋白纯化技术，获得高纯度 BsTrpRS 蛋白。利用 ITC 技术确证创新霉素与 BsTrpRS 之间亲和力为 3.2 μmol/L。通过晶体筛选优化，最佳结晶条件为 1.8 mol/L K2HPO4，pH 7.6，37 ℃，0.75%（v/v）1,3-丙二醇，最终获得 X-ray 衍射分辨率为 2.06 Å的 BsTrpRS/创新霉素二元复合物晶体，其晶胞参数为 a = 91.675 Å，b = 91.675 Å，c = 152.37 Å，α = 90.000°，β = 90.000°，γ = 120.000°，晶体的马修斯系数为 2.48 Å3/Da，最小非对称单位内含有 2 个蛋白分子，溶剂百分比为 50.46%。创新霉素与 BsTrpRS 复合物晶体结构的获得，有望对创新霉素小分子结构优化及设计提供指导方向及重要依据。

创新霉素； 色氨酰-tRNA合成酶； 共结晶； X-射线衍射

细菌耐药己经成为21 世纪全球面临的严重挑战之一，尤其革兰氏阳性菌出现了非常严重的耐药性[1]，如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、耐青霉素肺炎链球菌及耐万古霉素的肠球菌；……