程艳，万婷婷，薛荣亮

·论著·

PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体优化及蛋白表达

程艳，万婷婷，薛荣亮

710068 西安，陕西省人民医院麻醉科（程艳）；710100 西安，西安国际医学中心医院麻醉与舒适化医疗中心（薛荣亮）；100191 北京，北京大学第三医院麻醉科（万婷婷）

优化PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重组表达载体以增加 SOD 融合蛋白表达。通过基因工程设计引物并优化PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重组表达载体，扩增并鉴定目的基因，将优化后的原核重组表达载体以热激法转化至BL21(DE3) 中，通过 IPTG 诱导重组载体进行蛋白表达，通过溶菌酶 + 超声裂解菌体，离心后收集上清，利用 Ni-NTA 树脂纯化，10 kD，20 kD 透析袋浓缩，以获得 SOD 融合蛋白。利用 SDS-PAGE 凝胶电泳及 Western blot 鉴定 SOD 融合蛋白。采用 BCA 与黄嘌呤氧化酶法测定 SOD 融合蛋白浓度及活力。优化后的重组表达载体优化了稀有碱基，增加了 His·Tag 标签，His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD 序列作为一个整体，在I 与H I 限制性内切酶作用下定向插入，构建了长度为 6213 bp 的优化质粒，基因测序结果与预先设计的序列对比显示碱基序列正确。优化后的 SOD 融合蛋白表达量约占菌体的 32%，较前（20%）提高，纯化浓缩后纯度为 94%，较前（90%）增加。测定浓度为 1.8 mg/ml，37 ℃时 SOD 总活力为（3065.137 ± 19.75）U/mg prot。通过重组表达载体密码子优化，可以获得高产量、高活性的 SOD 融合蛋白。

蛋白质结构域； 超氧化物歧化酶； 质粒

过氧化反应与多种神经退行性疾病关系密切，其产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是造成神经元死亡的主要原因。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是针对 ROS 的主要抗氧化剂防御系统，但其分子量大且无特异性受体，难以穿过血脑屏障及细胞膜进入脑内发挥作用。……