沈力安?余汶潞?张彤

摘 要：为培养适用于混凝土自修复的微生物，本研究采用枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、“长安修复菌”对培养条件进行了研究。经过分析，选取37 ℃作为培养温度，营养物质采用蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、琼脂来促进微生物生长。在每1 000 mL培养基中加入锰离子，促进枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和“长安修复菌”生成芽孢;离心机转速采用5 000 r·min-1，最终成功培养出高纯度的芽孢悬液。

关键词：混凝土;微生物自修复;培养条件;枯草芽孢杆菌;芽孢悬液

中图分类号：TU528文献标识码：A文章编号：1003-5168（2021）05-0088-04

Abstract： In this study， Bacillus subtilis， Bacillus gelatinosus and "Chang'an repair bacteria" were used to study the culture conditions. After analysis， 37 ℃ was selected as the culture temperature， and peptone， beef extract powder， sodium chloride and agar were used to promote the growth of microorganisms. Manganese ion was added into every 1 000 mL medium to promote the spore formation of Bacillus subtilis， Bacillus gelatinosus and "Chang'an repair bacteria"; the centrifuge speed was 5 000 r·min-1， and finally the high-purity spore suspension was successfully cultivated.

Keywords： concrete;self-healing microorganism;culture condition;bacillus subtilis;spore suspension

近年来，采用微生物诱导矿化的混凝土自修复技术成为国际研究的热点。微生物自愈合是一种通过微生物自身生命活动与周围环境介质发生酶化作用并产生方解石等矿物化合物来修复混凝土内部或表面微裂缝的技术。同时，微生物诱导矿化自愈合的过程是一个绿色环保的裂缝修补过程，且可以在一定程度上改善混凝土本身的力学性能。

枯草芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌均属于革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌目前被广泛应用于微生物自修复混凝土的实验研究中。枯草芽孢杆菌在土壤和植物微生态中处于优势地位，繁殖速度快，营养要求简单，代谢产物也具有很高的酶活性，对大自然环境无污染，也不会危害农作物。作为一种有益的根际微生物，在农业生产及农作物病害预防上发挥了很大作用。目前，枯草芽孢杆菌在生产过程中的主要问题是芽孢的生产率较低，工业化大规模生产条件较为困难，成本较高等。胶质芽孢杆菌是一种广泛分布于土壤和岩石中的细菌，具有一定的矿物分解能力，能够分解出矿物中的钾、硅、磷等元素，同时也具有溶磷、释钾和固氮功能，在生长繁殖的过程中产生有机酸等物质。

为确定混凝土用微生物适宜培养条件，本文对枯草芽孢杆菌的生长培养条件进行了优化，引入了胶质芽孢杆菌和在土壤内提取的细菌作为参照，将优化后的培养条件用于三种菌株的培养，并检查芽孢悬液培养成效。

1 原材料与实验方法

1.1 微生物

本文所用微生物包括枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌，均由上海保藏生物技术中心提供。另外，从长安大学校园花园苗圃土壤内提取获得一种潜在细菌，为便于描述，所提取细菌暂命名为“长安修复菌”。

1.2 菌種扩大培养

在超净工作台上对上述三类菌种进行扩大培养。主要培养过程：0.5 mL无菌水振荡，菌体溶液呈悬浮状，无菌吸管吸出至斜面培养基中，放置于37 ℃恒温培养箱中进行第一代培养，培养时间为48 h。此后，采用划线法对第一代菌株扩大培养，得到第二代菌株和第三代菌株。

1.3 菌种芽孢培养

在超净工作台中，将第三代菌株划线培养到促芽孢培养基上，于恒温培养箱中倒置培养48 h，获得枯草芽孢杆菌芽孢、胶质芽孢杆菌芽孢、“长安修复菌”芽孢，并通过染色法在显微镜下完成芽孢鉴定。

1.4 芽孢悬液制备

用无菌水洗涤促芽孢培养基上的芽孢，并用无菌吸管转移至离心管中，将离心管放置于离心机内，在5 000 r·min-1转速下离心30 min，离心后保留下部沉淀部分，重新滴加无菌水并离心，重复以上步骤直至完成3次离心，最终制备出沉淀后的芽孢悬液。

2 微生物筛选与培养参数选择

2.1 微生物筛选

应用于自修复混凝土中的菌株必须满足以下条件：①在混凝土内部环境中存活;②具有在水泥基中沉淀碳酸钙的能力，从而实现在混凝土出现裂缝时表现出足够的自愈合能力。混凝土的内部环境复杂且具有很多限制因素，例如，pH值高、氧气浓度较低及混凝土生产时的高温、高压及机械应力。因此，筛选的菌株必须是耐高碱性的芽孢，使其可以在极端情况下生存。目前，微生物自修复混凝土主要使用革兰氏阳性细菌，常见的有芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。

基于此，本研究筛选了枯草芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌来复苏并扩大培养。同时，在长安大学校园花圃中取土壤表层5～10 cm下的肥土100 g左右，把土壤放入无菌采样袋中带回实验室分离、震荡、密封，通过90 ℃恒温水浴20 min，筛选出形成芽孢的细菌，制成1∶100浓度的土壤悬液。逐步稀释，获得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤悬液，吸取10-4、10-5、10-6土壤悬浊液0.2 mL，滴加到平板培养基上，于37 ℃恒温培养1～2 d。从上述平板中分别挑取单菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线培养。

挑选显微镜下呈杆状，菌落颜色、形状、质地、透明度均一致的菌体，进行菌株初步鉴定。挑取疑似芽孢杆菌的菌落，进行稀释、涂片，通过孔雀绿番红染色，用显微镜观察革兰氏染色情况，其中呈紫色的菌体即为革兰氏阳性菌，并对该菌进一步扩大培养。

2.2 培养温度

温度是影响细胞生长代谢的重要因素之一，它会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制和发酵液的理化性质，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成[1]。

考虑到单因素筛选对培养条件进行优化，因此除温度这一单一变量外，其他影响菌株生长的因素须保持一致。根据Sibel等学者的优化实验[2]，控制底物培养基浓度一致，在培养基接种完成后，设置培养温度为28、31、34、37、40 ℃，在24 h后测定培养皿的OD600nm值。结果表明，当恒温培养的温度为37 ℃ 时，菌体的生长量达到最高。温度高于或低于37 ℃，含菌数都有所下降。因此，本研究采用37 ℃培养温度对枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌以及“长安修复菌”进行培养。

2.3 氧气浓度

芽孢杆菌是属于需氧或者兼性厌氧的细菌，氧气在芽孢的培养过程中起着非常重要的作用，是影响培养效率的关键因素。有效氧浓度的增加，可以促进细菌、孢子和代谢物数量的增加，而有效氧的缺乏或减少，会限制生物的生命活动过程，影响发酵，导致孢子囊的溶解。根据Elsayed等的研究结果可知，枯草芽孢杆菌在限制氧气的条件下不会产生孢子，而在通气量为2 L/min时产芽孢量最高[3]。

2.4 培养基配方筛选

促进枯草芽孢杆菌产生芽孢的培养基应该由碳源、氮源、无机盐、生长因子和满足细菌代谢所需要的附加物质组成，且这些组成物质相互作用，在不同情况下对最终细菌孢子的产量具有不同程度的影响，所以促芽孢培养基需要营养物质的不同组合来优化和培养芽孢杆菌孢子。

不同种类和数量的碳氮源对枯草芽孢杆菌有着不同的影响。根据Elsayed等人的研究可知，20 g·L-1葡萄糖、2.5 g·L-1硫酸铵条件下枯草芽孢杆菌孢子浓度达到最大。Kardziani等人发现，培养基中葡萄糖浓度为2 g·L-1时孢子产量最高，较高的葡萄糖浓度会抑制产孢。Chen等人使用10种不同的碳氮源来探究产芽孢量的关键营养来源，发现利用玉米淀粉、麦麸、玉米粉、玉米浆、大豆粉和酵母提取物等制备的营养成分可高效生产枯草芽孢杆菌。

无机盐和微量元素等营养物质是枯草芽孢杆菌产生芽孢的关键条件，不同类型的无机盐对菌体生长和出芽的影响程度也不一样。在维生素和微量元素的影响下，枯草芽孢杆菌产生孢子的效果更好[3]。锰离子是芽孢形成的关键微量元素，郭夏雨通过实验发现，当Mn2+的浓度为2.4 mmol·L-1时，芽孢数量达到最高，随着Mn2+不断增加，芽孢数量逐渐减少，当Mn2+浓度为6 mmol·L-1时，几乎不能产生芽孢。虽然锰离子对芽孢的形成有显著的作用，但是锰离子对于细菌增殖没有明显作用[4]。

细菌和芽孢的生长都需要一个相对合适的酸碱度环境，而大部分菌体都能在中性环境下正常生长。pH值一方面可以影响细胞膜的电荷，引起原生质膜对个别离子透性的变化，同时也会影响微生物对营养物质的吸收、酶的形成等。研究表明，最适合枯草芽孢杆菌芽孢生长的pH值为7.0，且随着pH的不断增加，细菌数量和芽孢数量会不断下降。

根据上文分析，本实验的菌种最适宜的培养基组成是：玉米浆16.18 g·L-1、大豆粉17.53 g·L-1、酵母膏8.14 g·L-1、 （K2HPO4+KH2PO4）0.5 g·L-1，MnSO4·H20 0.2 g·L-1;产芽孢的底料初始pH值为7.0。

2.5 离心机转速

当对枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、“长安修復菌”培养三代之后，将对其进行芽孢培养，制作芽孢悬液。在制作芽孢悬液前，需要多次对枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌及“长安修复菌”进行无菌水洗涤冲洗和离心。然而，离心机转速的大小会影响芽孢的离心状态。根据赵甜宇等的实验研究可知，在优化制备菌剂的工艺时均采用5 000 r·min-1的转速来离心菌液，能成功得到离心良好的菌泥[5]。因此，本研究选择离心机转速为5 000 r·min-1。

3 研究结果

3.1 微生物扩大培养结果

培养流程如图1所示，第一、二、三代为在37 ℃培养温度下，以蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、琼脂为营养物质，培养后可观察到培养皿内已有大量微生物长出且生长状况良好。可见，37 ℃培养温度及此类营养物质非常适合枯草芽孢杆菌的生长。

图2为在校园土壤内提取微生物的样品。用无菌设备对花坛下的土壤进行取样，并制备土壤悬液，对土壤悬液进行梯度稀释后，获得分别稀释10-4、10-5、10-6后的液体，并对其进行涂布培养。其中，稀释[10-6]的土壤悬液单菌落分离，平板培养基内生长出了4个微生物。如图3所示，A、B、C分别为枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌及“长安修复菌”。其中，“长安修复菌”为挑选的疑似芽孢杆菌的菌落，通过革兰氏鉴定，菌体呈紫色。

3.2 芽孢鉴定

图4为在促芽孢培养基中提取的少量芽孢染色后的显微镜观察图，A、B、C分别为枯草芽孢杆菌芽孢、胶质芽孢杆菌芽孢和“长安修复菌”芽孢。通过观察可发现，培养基中含有大量绿色颗粒及少许紫色颗粒，绿色颗粒即生成的芽孢，而紫色颗粒则为未生成芽孢的微生物。可见，芽孢培养基中的营养物质配比可以有效促进枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和“长安修复菌”生成芽孢且芽孢生成率较高。

3.3 芽孢培养结果

图5中A、B、C分别为离心后的枯草芽孢杆菌芽孢悬液、胶质芽孢杆菌芽孢悬液和“长安修复菌”芽孢悬液。可见，在5 000 r·min-1转速下离心30 min可以有效去除杂质且芽孢均离心密实，表明该转速下可以离心得到较高纯度的枯草芽孢杆菌芽孢。

4 结论

结果表明，本研究确定的37 ℃培养温度、营养物质组成（蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、琼脂）适宜枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和“长安修复菌”生长。同时，以玉米浆、大豆粉、酵母膏为营养物质并加入一定量（K2HPO4+KH2PO4）、MnSO4·H20制成的促芽孢培养基顺利地制备了枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和“长安修复菌”芽孢。采用5 000 r·min-1的离心转速，顺利实现了三类微生物的芽孢提纯。

参考文献：

[1]上官文菲，陈合，陈婧，等.响应面法优化发酵乳杆菌产γ-氨基丁酸的培养条件[J].中国酿造，2019（12）：87-91.

[2] UZUNER S ， CEKMECELIOGLU D . Enhanced pectinase production by optimizing fermentation conditions of Bacillus subtilis growing on hazelnut shell hydrolyzate[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic，2015（1）：62-67.

[3] MONTEIRO S，CLEMENTE J J，CARRONDO M， et al. Enhanced Spore Production of Bacillus subtilis Grown in a Chemically Defined Medium[J].Advances in Microbiology，2014（8）：444-454.

[4]郭夏丽，狄源宁，王岩.枯草芽孢杆菌产芽孢条件的优化[J].中国土壤与肥料，2012（3）：99-103.

[5]赵甜宇，潘朝阳，张朝辉，等.固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备工艺研究[J].食品工业科技，2020（19）：104-111，120.