张晓丽 张晓红 叶 雷 朱 伟 庄乾英 沈方臻

1.山东省临沂市肿瘤医院内一科，山东临沂 276000；2.青岛大学医学院，山东青岛 266000；3.青岛大学医学院附属医院肿瘤三科，山东青岛 266000

肺癌是最常见的肿瘤类型之一，严重威胁人类的生存和健康，属致死率较高的恶性肿瘤之一。小细胞肺癌（small celllung cancer，SCLC）作为肺癌的一种特殊类型，属于恶性程度极高的神经内分泌癌，占肺癌发生率的20%～25%[1-3]，并且近年来发病率有升高的趋势，发生的主要原因是吸烟，也与其他环境因素、职业致癌物有关，其5年生存率极低；中老年发病率高，男性较女性多，主要的生物学行为有转移早、增长快、对初始化疗敏感、易耐药等。SCLC恶性程度高，复发率及死亡率远高于非小细胞肺癌（non-smalll cell lung cancer，NSCLC），目前的主要治疗手段局限于手术、放化疗，并且可手术的患者极少，因大部分患者发病时已失去手术机会，因此对SCLC基因学方面的深入研究，有望使分子靶向治疗成为一种有效的治疗新方案。

SASH1（SAM-and SH3-domaincontaining1）基因是2003年由Zeller等[3]首次发现，并提出其可能作为一种抑癌基因，属于进化上保守的SLY基因家族的一员。研究发现SASH1基因表达的蛋白产物在体内多种正常组织内广泛存在，而在多种恶性肿瘤中表达下调，如乳腺癌[3]、甲状腺癌[4]，并与肿瘤的增殖、侵袭和迁移相关[5-8]。本研究就SASH1基因在SCLC的表达及与相关病理特征的关系展开探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年2月至2018年2月临沂市肿瘤医院手术切除后经组织病理学诊断为SCLC石蜡标本，癌组织及癌旁组织各30例，其中男24例，女6例，平均年龄（59.20±2.12）岁。纳入标椎：①病理诊断为小细胞肺癌；②未行抗肿瘤治疗。排除标准：①肿瘤复发患者；②合并其他类型肿瘤或其他严重疾病。所有患者术前均无相关放化疗史，临床病历资料完善。本研究已经我院医学伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 观察指标

①SASH1蛋白在SCLC癌组织及其癌旁组织中的表达情况；②SASH1基因表达与SCLC临床病理特征（性别、年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移情况）的关系。

1.3 免疫组织化学染色

所有手术标本应用福尔马林固定，固定完成后标本行4 μm连续切片，常规脱蜡及水化后，应用柠檬酸盐溶液抗原修复处理，之后自然冷却至室温，再经3% H2O2阻断其内源性过氧化物酶活性。用10%山羊血清封闭，以抗SASH1多克隆抗体（abcam，ab111901）孵育，4℃过夜。次日复温至室温后使用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（中杉金桥，ZB2301）孵育，DAB显色。用苏木素染核1 min，并经过脱水、透明、封片、晾干过程。使用PBS代替一抗作为空白对照。

1.4 染色结果判读

应用双盲方法进行评估，由两位病理科经验丰富的医生在100倍镜下分别进行阅片。染色强度记为：0分：无染色；1分：淡黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色。按阳性细胞数百分比计分：0分：阴性；1分：≤10%；2分：11%～50%；3分：51%～75%；4分：＞75%。两项积分乘积＜3分判为阴性，≥3分判为阳性。之后进行统计学分析。

1.5 统计学分析

应用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计数资料以（%）表示，采用χ2检验，分析SASH1蛋白在SCLC中的表达及其与临床病理特征之间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SASH1蛋白在SCLC癌组织及其癌旁组织中的表达

SASH1蛋白主要在SCLC癌组织及癌旁组织的细胞质中表达，部分细胞核中亦有表达（图1）。30例癌组织中，有13例表达SASH1蛋白，表达阳性率为43.33%，30例癌旁组织中，有26例表达SASH1蛋白，表达阳性率为86.67%，差异有统计学意义（χ2=12.381，P＜0.001），见表1。

表1 SASH1蛋白在癌组织及癌旁组织中的表达

图1 SASH1蛋白在SCLC癌组织及其癌旁组织中的表达

2.2 SASH1基因表达与SCLC临床病理特征的关系

SASH1在无淋巴结转移组的阳性率（70.00%）高于有淋巴结转移组（30.00%），差异有统计学意义（P＜0.05）。SASH1在不同性别组、年龄组、肿瘤长径组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 SASH1基因表达与SCLC临床病理特征的关系

3 讨论

SCLC被认为是一种全身性疾病，以化疗为主联合放疗和（或）手术等综合性治疗。过去几十年治疗过程中，SCLC的一线化疗方案仍以依托泊苷联合铂类为主的方案，尽管其暂时对放化疗敏感，但很快出现复发和转移。近年来NSCLC靶向治疗突飞猛进，而SCLC近40年来的治疗缺乏突破性进展。因此，探索SCLC的基因学研究，能为SCLC的治疗带来一线希望。

SASH1基因是2003年Zeller等[3]在研究乳腺癌过程中发现的一种新基因，并提出该基因可能是乳腺癌一种新的抑癌基因。Zeller通过分析该基因，将其命名为SAM-andSH3-domaincontaining1。SASH1被认为影响肿瘤的侵袭和转移，这种推测在U251胶质瘤细胞[5]、A549人肺腺癌细胞[6]、A-375黑色素瘤细胞[7]、MG-63骨肉瘤细胞[6]中得到了证实。SASH1可通过多种途径应用于肿瘤的发生发展。现有的研究表明肿瘤抑癌基因SASH1的缺失或下调表达足以引起上皮细胞间充质转化（EMT）。E-钙黏蛋白的表达减少或缺失在肿瘤进展为侵袭性癌的过程中扮演着重要的角色，并且是EMT一个公认的标志物[9]。Dongre等[10]发现EMT的激活会引起细胞极性的丧失、细胞间连接的破坏、基底膜降解以及细胞外基质的重组。Franke等[11]在研究结肠癌中发现，SASH1的缺失可诱导上皮间充质转化，并且此过程通过CRKL介导的SRC信号途径。Zong等[12]发现，pcDNA3.1-SASH1可有效增加TSGH细胞中SASH1蛋白的表达，TGF-B1诱导E-钙黏蛋白下调及N-钙黏蛋白上调的情况在SASH1转染的TSGH细胞中逆转。EMT的分化过程将上皮细胞转化为侵袭性强的间充质样细胞，被认为是形成转移瘤的前提[13-15]。细胞因子诱导的EMT导致SASH1在癌细胞群中表达显著降低。而SASH1过表达减少了细胞迁移，增加了细胞基质黏附[16]。因此，多项证据表明，两者之间存在相互关系，并将SASH1作为EMT的关键负调控因子。缺氧诱导的EMT在胰腺癌中被证明可独立下调SASH1的表达[17]。因此在EMT过程中下调SASH1的表达可促进上皮细胞向间充质表型的转化。SASH1蛋白可调节信号转导，SASH1蛋白通过FAK及AKT/PI3K[4，18]调节信号，并且过度表达可促进凋亡[6，8]。有研究结果显示SASH1蛋白与ERK信号通路有很强的关联性，ERK信号通路中的重要成员MAP2K2和MAP4K4，与SASH1蛋白存在蛋白-蛋白相互作用，并且SASH1蛋白的表达抑制可以增强ERK1/2的磷酸化水平，意味着SASH1蛋白可能通过与MAP2K2和MAP4K4分子的相互作用参与了ERK信号通路，进而调节肿瘤细胞的增殖、转移、凋亡等细胞过程[19]。邝中淑等[20]证实了乳腺癌中p53与SASH1的表达存在一定的相关性，突变型及野生型SASH1基因上调内源性及外源性p53表达，该研究中发现突变型p53可抑制SASH1基因的表达，导致SASH1蛋白表达下调，从而在乳腺癌的发生过程中发挥至关重要的作用。根据以往的研究，SASH1基因的表达下调可能与SASH1启动子的高甲基化有关[3]。在对神经胶质瘤细胞株的研究中发现，SASH1蛋白过表达的细胞株中，MMP-2/9减低，而Caspases-3升高，提示SASH1蛋白可能干预神经胶质瘤细胞的增殖、凋亡等过程[5]。

本研究结果显示，SASH1蛋白在SCLC癌组织中的表达阳性率明显低于癌旁组织中的，有淋巴结转移的SCLC患者的SASH1阳性表达率低于无淋巴结转移的SCLC患者，差异有统计学意义，而SASH1在不同性别组、年龄组、肿瘤大小组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。通过以上结果，SASH1基因在SCLC癌组织及癌旁组织的表达的差异性，与此基因在其他癌种中的研究结果相符，提示SASH1基因可能是SCLC的抑癌基因。因SCLC能早期发现并行手术治疗的病例较少，导致本研究收集的样本量相对较少。笔者将继续致力于SASH1基因与SCLC的相关性研究，以期寻找SCLC新的治疗方法。