王欣 李磊 陈元友 吴潇

1.重庆医科大学附属第二医院彭水分院（彭水苗族土家族自治县人民医院） 重庆 409600

2.华中科技大学同济医学院附属普爱医院（武汉市第四医院）

心肌梗死是因冠状动脉闭塞造成急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，临床表现为剧烈胸骨后疼痛，可并发心律失常、心衰或休克，严重威胁人类生命健康[1]。《中国心血管病报告2018》结果显示，中国心血管病的发病率及病死率仍在逐年上升，急性心肌梗死是心血管疾病患者死亡的主要原因[2]。血管新生指在原有血管基础上生长形成新血管的过程，包括血管内皮细胞增殖、迁移、分化，毛细血管形成及管壁重构等，是机体对缺氧状态的一种自然响应过程[3]。研究证实，治疗性血管新生能够恢复缺血心肌血液供应，减少心肌组织梗死，改善患者预后，在心血管疾病治疗领域逐渐受到重视[4]。

柚皮素是传统中药枳实、枳壳中的有效活性成分，属二氢黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、调节脂质代谢和心脏保护等多种药理作用[5]。研究表明，柚皮素能够有效改善心脏功能，减轻氧化应激和心肌细胞凋亡，预防心肌梗死[6]。目前，虽已有研究证明柚皮素具有心脏保护作用，但其对心肌梗死后心脏的保护作用及机制仍需进一步探讨。本研究通过建立大鼠心肌梗死模型，深入观察柚皮素对血管新生及心功能指标的影响，并初步探究其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级SD大鼠50只，雌雄各半，6～8周龄，体质量180～220g，购于河南省实验动物中心［实验动物生产许可证号码：SCXK（豫）2017-0001］，饲养于河南省实验动物中心实验室独立动物房［实验动物使用许可证号码：SYXK（豫）2016-0002］。 饲养条件：室温（22±1）℃，湿度（50±10）%，每天定时换气，保持12h光暗照明，食水不限。本研究方案获华中科技大学同济医学院附属普爱医院（武汉市第四医院）伦理委员会批准（伦理审批号：HZKJDX201801002）。

1.2 主要试剂与仪器 柚皮素购于Sigma-Aldrich公司（批号：W530098）；阿司匹林肠溶片购于拜耳医药保健有限公司（批号：BJ49401）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒、Masson染色试剂盒、免疫组化检测试剂盒均购于北京索莱宝科技有限公司（批号：T8510、G1340、SP0041）；血小板内皮细胞黏附分 子 -1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源单克隆抗体、羊抗兔二抗均购于美国CST公司（批号：77699、2463、20102、5174、7074）。IX53显微镜为日本奥林巴斯公司产品；G:BOX多功能凝胶成像系统购于Syngene公司；多普勒超声仪购于美国Beckman公司；Multiskan MK3酶标仪为Thermo Fisher Scientific公司产品；TGL16MB高速冷冻离心机购于长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与造模 将50只SPF级SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组，每组10只。模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组大鼠参考文献[7]的方法，通过结扎冠脉动脉前降支，建立心肌梗死模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰卧位固定于手术台，经口行气管插管，连接呼吸机辅助呼吸。胸前区备皮消毒，于胸骨左侧第3、4肋间开胸，暴露心脏，在冠脉动脉前降支下2～3mm处结扎冠状动脉，可见局部心肌由红色变为白色，收缩减弱，将心脏回纳胸腔，缝合伤口。若心电图可见Ⅱ导联ST段较手术前抬高0.2mV以上则视为造模成功。术后观察提示，模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组大鼠均造模成功，无大鼠死亡。假手术组大鼠仅开胸，不行冠脉结扎。从造模当天开始，各组大鼠予肌肉注射4万U青霉素预防感染，1次/d，连续3d。

1.3.2 给药方法 造模后第2天开始给药。根据预实验结果，柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组大鼠分别予100mg·kg-1和50mg·kg-1柚皮素（药物以0.5%羧甲基纤维素钠溶液混合均匀）灌胃，阿司匹林组大鼠予100mg·kg-1阿司匹林肠溶片（药物研磨后溶解于0.9%氯化钠溶液）灌胃，假手术组和模型组大鼠予20mL·kg-10.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d，连续4周。

1.3.3 心功能指标检测 末次给药后2h采用多普勒超声仪检测大鼠心功能指标，检测指标包括左室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）、左室短轴缩短率（left ventricular factional shortening，LVFS）、左室收缩末期内径（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）和左室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD），连续检测3个心动周期，取平均值作为检测数据。

1.3.4 标本制备 处死大鼠，分离心脏，每组各取5只大鼠心脏以4%多聚甲醛溶液固定，用于HE染色、Masson染色和免疫组化染色；每组余下5只大鼠心脏组织-80℃冻存，用于Western blot检测。

1.3.5 大鼠心肌组织病理学观察

1.3.5.1 HE染色观察心脏组织病理变化 大鼠心脏组织在4%多聚甲醛溶液中固定48h后，蒸馏水清洗，梯度乙醇脱水，制作蜡块，冰上预冷4μm切片，二甲苯脱蜡30min，梯度乙醇及蒸馏水中复水，HE染色，脱水、透明后中性树胶封片，光镜下观察大鼠心脏组织病理变化。

1.3.5.2 Masson染色观察心脏组织纤维化情况 取4%多聚甲醛溶液固定的大鼠心脏组织，切片、脱蜡、复水过程同1.3.5.1。Weigert铁苏木素染色5min，酸性乙醇分化5～15s，Masson蓝化液返蓝3～5min，丽春红酸性品红染液染色5～10min，弱酸工作液（蒸馏水:弱酸溶液=2:1）洗涤1min，磷钼酸溶液染色1min，弱酸工作液洗涤1min，苯胺蓝染色1～2min，弱酸工作液洗涤1min，95%乙醇和无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察心脏组织纤维化情况。

1.3.6 免疫组化染色检测CD31表达水平和微血管密度（microvascular density，MVD） 取大鼠心脏组织制作石蜡切片，方法同1.3.5.1。60℃烤片2h，二甲苯脱蜡2h，梯度乙醇复水，随后进行抗原修复、封闭，滴加以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释的CD31兔源单克隆抗体（稀释比例为1:100），放入湿盒中，4℃过夜，次日加入羊抗兔二抗37℃孵育0.5h，PBS冲洗后加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液，苏木精染细胞核，梯度乙醇脱水，中性树胶封片，光镜下观察。CD31阳性细胞可被染成棕黄色，主要分布于梗死区周边范围，梗死区少见。随机选取梗死周边区域5个视野，计算CD31呈阳性的微血管数量，取平均值，即MVD。使用Image Pro Plus Version 6.0分析CD31阳性表达的光密度（integral optical density，IOD）值，IOD值越高代表CD31阳性表达率越高。

1.3.7 Western blot检测VEGF和bFGF蛋白表达水平 取冻存的大鼠心脏组织，冰上研磨，离心取沉淀，加入裂解液提取肺组织蛋白，蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），上样后80V电泳2h，60V转膜2h，5%脱脂奶粉封闭2h，随后将条带放入VEGF、bFGF兔源一抗稀释液中，稀释比例均为1∶1 000，4℃过夜，次日以含吐温的Tris缓冲盐溶液（Tris buffered saline tween，TBST）缓冲液清洗后加入羊抗兔二抗（稀释比例：1∶2 000），37℃孵育2h，洗膜，滴加发光液，置于凝胶成像系统显影。以GAPDH为内参蛋白，采用Image J软件分析各蛋白对应的灰度值，计算蛋白的相对表达量，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.4 统计学分析 应用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析，实验重复3次，计量资料以±s表示，多样本比较采用单因素方差分析，两样本比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标比较 各组间总体比较，LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD指标差异有统计学意义（P＜0.01）。与假手术组比较，模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组LVEF和LVFS均降低，LVESD和LVEDD均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，阿司匹林组、柚皮素高剂量组柚皮素低剂量组LVEF和LVFS增加，LVESD降低，LVEF和LVFS增加，LVESD和LVEDD降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与阿司匹林组比较，柚皮素高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），柚皮素低剂量组LVEF和LVFS降低，LVESD和LVEDD增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与柚皮素高剂量组比较，柚皮素低剂量组LVEF和LVFS降低，LVESD和LVEDD增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表1。

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s，n=10）Tab.1 Comparison of cardiac function indexes in each group （±s，n=10）

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s，n=10）Tab.1 Comparison of cardiac function indexes in each group （±s，n=10）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与阿司匹林组比较，△P＜0.05；与柚皮素高剂量组比较，▲P＜0.05Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with aspirin group，△P＜0.05;compared with naringenin high-dose group，▲P＜0.05

组别 LVESD（mm） LVEDD（mm） LVEF（%） LVFS（%）假手术组 4.77±0.88 6.95±0.98 78.70±4.88 42.50±3.01模型组 9.18±1.36* 10.44±1.41* 38.29±2.11* 16.55±2.12*阿司匹林组 7.06±1.18*# 8.74±1.33*# 54.33±3.27*# 24.85±2.54*#柚皮素高剂量组 7.18±1.09*# 8.69±1.29*# 54.98±3.02*# 24.51±2.68*#柚皮素低剂量组 8.11±1.21*#△▲ 9.35±1.15*△▲ 49.67±2.74*#△▲ 21.75±2.02*#△▲

2.2 各组大鼠心肌组织形态观察 HE染色结果显示，假手术组心肌组织结构正常、完整，心肌细胞分布均匀、有序，轮廓清晰可见，胞核与胞质边缘分明，血管管腔完整。与假手术组比较，模型组心肌组织存在着色较浅、组织排列紊乱、细胞轮廓不清晰和细胞破碎等现象，伴有炎症细胞浸润。与模型组比较，柚皮素高剂量组心肌组织排列较为整齐，着色均匀，有少量炎症细胞浸润，血管管腔完整度较好，但阿司匹林组和柚皮素低剂量组心肌组织仍存在一定程度排列紊乱和心肌细胞核质不清晰的现象，整体着色较浅。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织形态变化（HE染色，400×）Fig.1 Morphological changes of myocardium in each group（HE staining，400×）

2.3 各组大鼠心肌胶原组织变化观察 Masson染色结果显示，假手术组心肌组织形态完整、清晰，镜下视野呈紫红色，部分血管周围有少量呈蓝色的胶原组织。与假手术组比较，模型组心肌组织排列紊乱，呈紫红色的心肌组织明显减少，存在大量呈蓝色的胶原纤维，血管破碎，部分血管呈管腔狭窄和闭合现象。与模型组比较，柚皮素高剂量组和阿司匹林组均以紫红色心肌组织为主，蓝色胶原纤维大量减少，但柚皮素低剂量组仍存在较多的蓝色胶原纤维组织，且分布较紊乱。见图2。

图2 各组大鼠心肌胶原组织形态变化（Masson染色，400×）Fig.2 Morphological changes of myocardial collagen tissue in each group（Masson staining，400×）

2.4 各组大鼠免疫组化CD31表达及MVD比较 各组间总体比较，CD31表达水平与MVD数量差异有统计学意义（P＜0.01）。与假手术组比较，模型组CD31表达水平和MVD增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组CD31表达水平增加（P＜0.05），柚皮素高剂量组和低剂量组MVD增加（P＜0.05）；与阿司匹林组比较，柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组CD31表达水平和MVD增加（P＜0.05）；与柚皮素高剂量组比较，柚皮素低剂量组CD31表达水平和MVD降低（P＜0.05）。见图3、表2。

表2 各组大鼠免疫组化CD31表达及MVD比较（±s，n=5）Tab.2 Comparison of CD31 expression and MVD in each group（±s，n=5）

表2 各组大鼠免疫组化CD31表达及MVD比较（±s，n=5）Tab.2 Comparison of CD31 expression and MVD in each group（±s，n=5）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与阿司匹林组比较，△P＜0.05；与柚皮素高剂量组比较，▲P＜0.05Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05;compared with model group，#P＜0.05;compared with aspirin group，△P＜0.05;compared with naringenin high-dose group，▲P＜0.05

组别IOD MVD（个）假手术组 5.89±0.54 2.41±0.22模型组 10.44±0.67* 4.98±0.39*阿司匹林组 13.72±0.58*# 5.68±0.52*柚皮素高剂量组 50.96±0.91*#△ 10.36±0.55*#△柚皮素低剂量组 19.37±0.87*#△▲ 7.99±0.39*#△▲

图3 各组大鼠免疫组化CD31表达比较（400×）Fig.3 Comparison of immunohistochemical CD31 expression in each group（400×）

2.5 各组大鼠心肌组织VEGF、bFGF蛋白表达比较 假手术组、模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组VEGF蛋白相对表达水平分别为（0.17±0.03）、（0.30±0.04）、（0.81±0.07）、（1.08±0.09）、（0.77±0.08）；bFGF蛋白相对表达水平分别为（0.15±0.02）、（0.26±0.03）、（0.69±0.05）、（1.05±0.08）、（0.75±0.08），各组间总体比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。与假手术组比较，模型组、阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组VEGF、bFGF蛋白表达水平增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组VEGF、bFGF蛋白表达水平增加（P＜0.05）。柚皮素高剂量组VEGF、bFGF蛋白表达水平高于阿司匹林组和柚皮素低剂量组 （P＜0.05），柚皮素低剂量组与阿司匹林组VEGF、bFGF蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 各组大鼠心肌组织VEGF和bFGF蛋白表达比较Fig.4 Comparison of VEGF and bFGF protein expression in myocardial tissues in each group

3 讨论

心肌梗死是心血管疾病相关的主要死亡原因，常见治疗方法包括药物治疗、溶栓治疗、介入治疗及冠脉搭桥术等，虽然对于该类疾病的预防和治疗研究已取得成效，但该病的发病率和病死率依然居高不下，且上述常见疗法对于冠状动脉远端弥漫性病变、复发性病变及无法手术的严重多支病变效果不佳[8-9]。近年来，治疗性血管新生成为心绞痛、心肌梗死等心血管疾病临床治疗的研究热点。新生血管的生成和发展是对器官病理性损害或缺血缺氧的重要潜在补救措施，通过各种疗法促使心肌缺血区血管新生能够为冠脉提供有效的侧支循环，从而改善心脏功能，治疗心肌梗死[10]。柚皮素是广泛存在于芸香科植物中的一种二氢黄酮类化合物，也是多种中药的主要有效成分。研究表明，柚皮素对多种原因导致的心肌损伤具有保护作用，能够改善心肌细胞凋亡和心肌纤维化，抑制心脏骤停大鼠的心脏衰竭和心肌损伤[11-12]。然而，柚皮素是否具有促进心肌梗死后血管新生的作用尚未明确，本研究构建了大鼠心肌梗死模型，旨在观察柚皮素对心肌梗死大鼠血管新生的影响，并初步探究其作用机制。

LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD是评价心脏功能的常用指标，本研究中多普勒超声结果显示，模型组LVEF和LVFS均降低，LVESD和LVEDD均增加，而阿司匹林、高剂量和低剂量柚皮素可增加LVEF和LVFS，降低LVESD和LVEDD，表明心肌梗死后大鼠心功能显著降低，出现明显心室扩张和重构，阿司匹林、高剂量和低剂量柚皮素可显著改善大鼠心脏功能，减轻心肌梗死后出现的失代偿性心室扩张。心肌细胞属于终末细胞，心肌梗死会导致不可逆转的组织缺血坏死，从而诱发机体的自我保护反应，包括早期无菌性炎症反应和修复期成纤维细胞增殖、瘢痕形成及血管新生等活动，然而持续的炎症损伤和过度的修复反而会加剧细胞死亡和心肌收缩功能障碍，不利于心功能的改善[13-14]。本研究采用HE染色和Masson染色观察各组大鼠心肌梗死后心肌组织病理生理学改变。结果显示，心肌梗死对大鼠心肌组织造成明显损伤，大量胶原纤维增生，但柚皮素可改善大鼠心肌损伤现象，使胶原纤维沉积减少，其中高剂量柚皮素的效果优于低剂量，表明一定剂量的柚皮素能够显著抑制心肌梗死导致的组织损伤，减轻心肌组织胶原纤维的沉积。

CD31是内皮细胞的特异性标志物，在评价血管新生情况时多采用CD31免疫组化染色来统计MVD，以此反映血管的生成情况[15]。本研究结果显示，心肌梗死后心肌组织CD31表达水平和MVD增加，而阿司匹林及不同剂量的柚皮素均可增加心肌组织CD31表达水平和MVD，其中柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组CD31表达水平和MVD显著高于阿司匹林组，表明柚皮素能够显著增加大鼠心肌梗死后心梗边缘区域CD31的表达，有效促进血管新生。VEGF是特异性最高、作用最强的促血管生成细胞因子，能够特异性作用于血管内皮细胞，促进细胞增殖、出芽、迁移和血管形成过程，已被证明可促进缺血性心脏病患者血管新生[16]。bFGF是一种生长刺激因子，能够特异性作用于血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞及神经细胞。已有研究证实，VEGF和bFGF在促进血管新生过程中有明显的协同效应[17]。本研究结果显示，模型组VEGF、bFGF蛋白表达水平高于假手术组，表明大鼠心肌梗死后，机体出现代偿反应；与模型组比较，阿司匹林组、柚皮素高剂量组和柚皮素低剂量组VEGF、bFGF蛋白表达水平增加，其中柚皮素高剂量组VEGF、bFGF蛋白表达水平高于阿司匹林组和柚皮素低剂量组，表明柚皮素促进血管新生的作用可能与VEGF、bFGF蛋白表达水平升高密切相关。

综上所述，柚皮素能够改善心肌梗死大鼠的心功能，减轻心肌梗死后的组织损伤和胶原沉积，有效促进血管新生，其作用机制可能与促进VEGF、bFGF蛋白表达升高有关。