熊永洁， 殷启润， 李 静， 刘德义， 贺绍君

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

热应激作为一种非特异性的环境应激，可对畜禽的生产繁殖效率、生产性能产生诸多不利影响。随着畜牧业集约化和产业化程度的不断提高，由于受到降温成本、降温设备设施和降温效率等诸多因素的影响，规模化饲养的经济动物，尤其是种公畜往往长时间处于热应激状态而影响养殖经济效益，如引起睾丸生殖激素分泌功能紊乱、睾丸生理机能减退、精液品质急剧下降、死精数量和精子畸形率增加，造成公畜种用性能急剧下降，进而严重影响养殖的经济效益。因此，如何有效预防和减少热应激对公畜繁殖能力的危害、进而提高公畜的精液品质和种用价值，是夏季规模化养殖业面临的主要问题。α-硫辛酸(Alpha lipoic acid，ALA)作为B族维生素家族成员的一类亲脂性化合物，具有独特的抗炎、抗氧化等药理活性。据报道，α-硫辛酸能够显著降低热应激饲养条件下肉鸡的料肉比、改善屠体的肉品质。但是α-硫辛酸能否有效缓解热应激引起的雄性动物睾酮分泌失调，目前仍不清楚。本研究以雄性小鼠为实验模型，探究α-硫辛酸对热应激诱发的睾酮分泌失调的影响以及可能的作用机理，以期为防控夏季雄性动物热应激提供理论支持和实验基础，为热应激防治药物的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

α-硫辛酸(饲料级，广州盛瑄食品添加剂有限公司)；睾酮酶联免疫吸附检测快速试剂盒(上海碧云天生物技术公司)；免疫组化切片染色Ultra-SensitiveSP商品化试剂盒(福建福州迈新生物公司)；组织全蛋白快速提取与分离试剂盒;二辛可宁酸法(Bicinchonininc acid，BCA)蛋白浓度分析试剂盒(江苏南京凯基生物技术公司)；IRE1、Caspase-3、β-actin一抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；羊抗兔和羊抗鼠二抗(上海碧云天生物技术公司)；蛋白免疫印迹化学发光超敏检测试剂盒(美国伯乐公司)。

1.2 实验动物饲养与处理

8周龄SPF级雄性昆明近交系性成熟小鼠60只，体重32～35 g，购自济南朋悦实验动物公司安徽代理分公司，实验动物许可证号：SCXK(鲁)2019003，饲养于安徽科技学院人工气候控制室科研实验鼠房，在室温(24±1) ℃下，每日08:00-20:00给予光照，自由饮水和采食，各组小鼠均饲喂商品化实验鼠粮。正常饲养3 d后，将小鼠随机分为3组：正常饲养对照组(Con)、热应激饲养组(HS)、α-硫辛酸+热应激饲养组(ALA+HS)，每组20只。实验开始后，对照组的室温维持在(24±1) ℃，热应激组和α-硫辛酸+热应激组从10:00-17:00维持室温(35±1) ℃。α-硫辛酸的给药方式以及剂量参照卢斌等的研究报道进行,将α-硫辛酸采用生理盐水溶解后，每天09:00对α-硫辛酸+热应激组小鼠按照60 mg/kg的剂量进行α-硫辛酸灌胃给药，对照组和热应激组分别给予等体积的生理盐水。实验进行14 d后处死小鼠，分别采集血液和睾丸，用于相关指标的检测。

1.3 血清睾酮含量检测

将采集的血液置于4 ℃冰箱静置过夜后分离收集血清，采用睾酮酶联免疫吸附检测试剂盒测定血清中的睾酮(Testosterone, T)含量，检测方法和程序按照试剂盒说明书进行。

1.4 石蜡切片免疫组化染色

睾丸组织石蜡切片经脱蜡、入水、微波抗原修复后，采用商品化的免疫组化染色试剂盒检测IRE1蛋白在小鼠睾丸中的表达定位。滴加试剂盒A液(内源性过氧化酶阻断剂)，室温条件下孵育0.5 h之后用PBS清洗3次，进行封闭操作，滴加试剂盒B液(封闭液)使之完全覆盖载玻片上的组织，于37 ℃恒温箱中放置1 h；滴加IRE1一抗孵育过夜。取出并用PBS清洗切片3次，进行第二抗体结合与孵育，滴加试剂盒C液(生物素标记的第二抗体)，于37 ℃电热恒温箱中静置孵育1 h。二抗孵育处理结束后，滴加适量的试剂盒D液(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶)，于37 ℃电热恒温箱中孵育15 min，随即进行目的蛋白显色、复染、脱水、封片和显微观察拍照。

1.5 蛋白免疫印迹Western blot 检测

从液氮罐中取出已收集的各组睾丸组织样品，加入适量体积的全蛋白提取试剂盒中已经预冷处理的蛋白裂解液及PMSF，低温条件下匀浆处理后，4 ℃低温离心机12 000 r/min离心15 min后吸取上清液，然后采用BCA法对上清进行蛋白浓度定量检测，所获蛋白上清液置于-80 ℃超低温冰箱保存。Western blot 检测时，取35 μg蛋白样品进行10% SDS-PAGE电泳，65 V条件下将蛋白样品采用湿转的方式进行转移作用1.5 h，待蛋白转移至硝酸纤维素薄膜上之后，取出薄膜放入封闭液中室温封闭1 h。封闭结束后添加IRE1一抗4 ℃孵育过夜。次日经洗膜操作后，于样品薄膜上滴加碱性磷酸酶(AP)标记的第二抗体，随即在摇床上轻摇1.5 h进行二抗孵育。二抗孵育结束后，再次洗膜，最终在每张膜上分别滴加200 μL蛋白免疫印迹化学发光液，分析测定各蛋白条带的灰度值以进行蛋白表达量的定量分析。

1.6 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 硫辛酸对热应激小鼠血清睾酮含量水平的影响

由图1可以看出，与对照组(Con)相比，热应激组(HS)小鼠血清睾酮含量水平显著降低，差异极显著(

P

<0.01)；与热应激组相比，α-硫辛酸+热应激处理组(ALA+HS)的血清睾酮含量显著上升(

P

<0.05)，含量上升40.68%。

图1 硫辛酸对热应激小鼠血清睾酮含量水平的影响

2.2 硫辛酸对非折叠蛋白反应信号基因IRE1在小鼠睾丸中蛋白表达定位的影响

从图2可得，在各组小鼠睾丸的生精小管和睾丸间质中均可见IRE1蛋白的阳性免疫染色细胞；与对照组相比，热应激组睾丸组织中的IRE1蛋白阳性免疫染色细胞数量明显增多(

P

<0.05)(图3)；但与热应激组相比，α-硫辛酸+热应激处理组睾丸的生精小管和间质中IRE1蛋白的阳性免疫染色细胞数量显著减少(

P

<0.05)，详见图2。

图2 硫辛酸对热应激小鼠睾丸中IRE1蛋白阳性细胞数的影响

图3 IRE1在热应激小鼠睾丸中的表达定位

2.3 硫辛酸对非折叠蛋白反应信号基因IRE1在热应激小鼠睾丸中蛋白表达量变化的影响

从图4～5可以看出，与对照组相比，热应激组、α-硫辛酸+热应激处理组中睾丸组织内的IRE1蛋白表达水平均显著增加(

P<

0.01，

P<

0.05)；但与热应激组相比，α-硫辛酸+热应激处理组中睾丸内IRE1蛋白表达量显著降低(

P

<0.05)。

图4 Western blot法检测IRE1在热应激小鼠睾丸中的蛋白表达量变化

图5 IRE1蛋白相对表达量分析

2.4 硫辛酸对凋亡调节基因Caspase-3在热应激小鼠睾丸中表达的影响

从图6～7可以看出，与对照组相比，热应激组、α-硫辛酸+热应激处理组中睾丸组织内的Caspase-3蛋白表达水平均显著增加(

P<

0.01，

P

<0.05)；但与热应激组相比，α-硫辛酸+热应激处理组中睾丸内Caspase-3蛋白表达量显著降低(

P

<0.05)。

图6 Western blot法检测Caspase-3在热应激小鼠睾丸中的蛋白表达量变化

图7 Caspase-3蛋白相对表达量分析

3 结论与讨论

随着人工授精技术在现代畜牧养殖业中的大规模推广和应用，公畜繁殖性能的高低直接影响着养殖的经济效益。但是，目前对于热应激造成公畜繁殖功能障碍的研究，大多数集中于热应激对精子生成的影响方面。而睾酮作为睾丸分泌的重要生殖激素，在促进雄性动物精子成熟以及维持第二性征等方面发挥了重要作用。因此，如何有效降低和预防热应激对公畜睾酮分泌的不利影响，进而提升公畜的精液品质，对提升夏季公畜的繁殖性能和养殖的经济效益具有重要意义。本实验以雄性昆明小鼠为研究模型，探索α-硫辛酸对高温热应激状态下小鼠睾酮分泌水平的影响，以期为合理使用α-硫辛酸防控畜禽热应激提供理论依据。

对于雄性动物，睾酮主要来源于睾丸间质细胞，受下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)和诸多细胞因子的调控。睾酮对促进生殖器官发育和精子发生，以及维持第二性征等具有重要意义。热应激诱导睾酮分泌水平降低后，往往出现精子发生与成熟异常，导致精液品质严重下降，即使消除引起热应激的不利因素后，也需要10周左右的缓冲时间，精液品质才能完全恢复正常。同时，睾酮在其他组织器官的正常生理活动中也发挥了重要作用，如维持机体的骨量、参与维持神经和心脑血管系统的正常生理功能，调节皮脂腺的皮脂分泌功能等。目前，随着对热应激发生发展机制研究的不断深入，现有研究结果表明在热应激发生过程中维持睾丸睾酮的正常分泌水平，对防治雄性动物热应激、降低和消除热应激对其繁殖生产性能的不利影响显得尤为重要。本试验结果显示，热应激显著降低了血清中睾酮的含量，表明热应激处理降低了睾丸分泌睾酮的能力，损害了睾丸分泌生殖激素的正常生理功能，这与前人的研究发现热应激能够引起雄性动物生殖激素分泌功能障碍的研究结果相一致。而本研究发现给予α-硫辛酸后血清中睾酮的含量显著升高，表明α-硫辛酸能够增强睾丸在热应激条件下分泌睾酮的能力，进而缓解热应激对睾丸生殖生理功能造成的损害。

热应激发生时，机体内热休克蛋白的合成数量急剧上升。内质网作为动物体内新生蛋白修饰、成熟的重要部位和场所，未折叠新生蛋白数量的急剧增加可破坏内质网的平衡状态而使之发生内质网应激。内质网应激发生后，一系列应激相关的压力应激信号反应与转导通路被激活，诱发细胞和机体产生一系列适应性反应，即非折叠蛋白反应(Unfolded proteins response，UPR)，以期恢复内质网的平衡状态，从而对细胞和机体起到保护作用。现有研究表明，肌醇需求酶1(Inositol requiring enzyme 1，IRE1)作为UPR信号通路中关键的应激感知与信号转导因子，热应激发生时， IRE1参与了热应激信号的转导与调控过程。本研究的免疫组化检测结果显示，在各组小鼠睾丸的生精小管和睾丸间质细胞中均观察到了IRE1蛋白的阳性免疫染色，且热应激处理后IRE1蛋白的阳性免疫染色明显加深，但与热应激组相比，在α-硫辛酸处理组睾丸中IRE1蛋白的免疫染色明显变弱。同时，Western blot检测结果显示，IRE1蛋白在热应激组睾丸中的表达量较对照组显著升高，而α-硫辛酸处理组的IRE1蛋白表达量较热应激组明显降低，表明热应激可能通过增强IRE介导的UPR信号进而影响睾丸的睾酮分泌功能，而α-硫辛酸在热应激条件下呈现出增强睾丸睾酮分泌的作用，可能与其抑制了IRE介导的UPR信号激活有关。

现有研究表明，热应激对UPR信号通路的持续或过度激活能够诱导细胞线粒体凋亡途径的激活进而引起机体组织细胞的凋亡，最终对组织器官的生理功能造成损伤。Caspase-3作为线粒体细胞凋亡途径中信号转导的一个关键凋亡调控因子，在以细胞线粒体为中心的凋亡信号转导途径中扮演了凋亡执行者的重要角色，其表达量的增加是细胞凋亡的一个重要标志。本实验结果显示，热应激显著诱导了Caspase-3蛋白在睾丸内的表达，表明热应激诱发了睾丸组织细胞的凋亡，凋亡的异常增加损害了睾丸正常的生理生殖功能，进而影响了睾丸分泌睾酮的能力；而与热应激组相比，α-硫辛酸显著抑制了睾丸内Caspase-3的蛋白表达，表明α-硫辛酸能够有效抑制热应激状态下睾丸组织细胞的凋亡，增强睾丸睾酮的分泌能力，进而缓解热应激对睾丸生理功能产生的不利影响。

综上所述，本研究结果表明，热应激能够损害小鼠睾丸睾酮的正常分泌能力、降低其体内血清睾酮的含量，给予60 mg/(kg·d)的α-硫辛酸治疗对高温热应激引起的小鼠血清睾酮含量下降具有良好的治疗作用，其发挥保护作用的机制可能与α-硫辛酸抑制了IRE1介导的非折叠蛋白反应信号通路激活、降低凋亡促进基因Caspase-3在睾丸中的蛋白表达量有关。