沈梦茹， 刘丽琴， 李 婷， 李杰勤， 刘言龙， 颜学慧， 梁 缘， 詹秋文

(安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100)

高粱[

Sorghum

bicolor

(L.) Moench]为禾本科高粱属一年生草本植物，具有抗旱、耐涝、产草量高、营养价值高、抗逆性强等特点。高粱作为饲料作物，其产草量是玉米、苜蓿等的2～6倍。另外高粱的营养价值高，富含多种维生素和微量元素及氨基酸，制成青贮饲料，含有丰富的粗纤维、粗蛋白和粗脂肪。目前我国饲草资源短缺，随着畜牧业结构的调整，牛、羊等草食动物将不断增加，因此高粱作为饲料作物综合开发利用前景广阔。

大多数植物的叶片为绿色，因为叶片中含有叶绿体的细胞器。叶绿体中含有叶绿素、叶黄素和胡萝卜素等色素，由于叶片中色素的比例不同从而产生多种叶色，其中包括条纹、黄化、白化、斑点和紫叶等。国内对紫色叶片这一性状的研究主要集中在其杂种纯度的快速检测上，很多育种家试图将其运用于苗期鉴定。曾运华等利用幼苗紫色性状有无来检验种子的纯度；沈又佳等在种子纯度鉴定方法中利用杂交水稻种子纯度的牙鞘色来鉴定种子纯度；杨秀英等利用幼苗芽鞘颜色鉴定玉米杂交种种子纯度。但是对于高粱紫叶研究还未见相关报道。

本研究旨在利用高粱非紫叶Tx430和高粱紫叶IS31557进行杂交的F分离群体，探讨高粱紫叶的生理特性及遗传特点，并利用分子标记对控制紫叶

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1基因进行初定位，这将为进一步开展紫叶

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1基因精细定位和基因克隆奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

高粱非紫叶Tx430和高粱紫叶IS31557种子由安徽省饲草育种与利用重点实验室提供。

1.2 定位群体的构建

前期，将高粱非紫叶Tx430(母本)与高粱紫叶IS31557(父本)进行杂交获得F单株，然后套袋自交获得F代。2020年5月，将亲本高粱Tx430、高粱IS31557以及F和F代均种植于安徽科技学院种植科技园。高粱Tx430和高粱IS31557各种植30株，F分离群体共1 000株。种植密度为行距50 cm，株距30 cm，每行10株，随后进行田间常规管理，待紫叶表现出后及时调查统计和分析。

1.3 花青素的测定

在高粱3叶期，分别取Tx430和IS31557植株的叶片及光照强度在2 400 lx和7 000 lx下培养IS31557植株的叶片。每组取3株即三个重复，并分别进行花青素的提取。

花青素提取参照于晓南等方法略有改进。将样品剪成1～2 mm碎片，称取1.00 g，然后放进50 mL 三角瓶，加入10 mL 0.1 mol/L盐酸，用锡纸将瓶口封紧，置于32 ℃恒温振荡器中浸提4 h，200 r/min，取出滤液，滤液作为待测溶液。用METASH V-5100型可见分光光度计测量530 nm处吸光度，以0.l mol/L盐酸作为空白对照，计算花青素的含量。花青素相对含量(单位/g，10 mL 0.1 mol/L盐酸)为10AB，式中,10表示将吸光度换算为花青素单位，A表示测得的吸光度，B表示稀释倍数。

1.4 DNA的提取

对亲本及叶色为绿色的F单株提取DNA，参照磁珠法，取嫩叶片0.1 g，加液氮研磨成粉末，加600 mL快速裂解液摇匀，65 ℃水浴10 min，每隔一段时间上下颠倒一下,12 000 r/min下离心5 min；吸取上清400 μL至1.5 mL离心管中，加入混合液820 μL(400 μLDNA结合液和400 μL异丙醇和20 μL磁珠悬浮液)，充分混匀；室温静置5 min，将混匀液静置1 min；倒掉上清，加入400 μL 70%的乙醇，充分混匀后，静置1 min；重复上步一次，将离心管置于磁力架上风干10 min；加入150 μL双蒸水，充分混匀，并在65 ℃水中水浴3 min；静置2 min,将上清吸出，备用。

1.5 SSR反应体系及PCR的扩增

PCR反应体系采用10 μL体系：10×Buffer 1.0 μL，引物：前引物0.75 μL (10 μmol/L)，后引物0.75 μL (10 μmol/L)，dNTP 0.5 μL (25 mmol/L)，DNA 2.0 μL (30 ng/μL),双蒸水4.5 μL，Taq酶0.5 μL，扩增反应在BIO-RAD S-1000梯度PCR仪上进行。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，37个循环；最后再7 ℃延伸7 min，4 ℃保存。扩增产物中加入2.0 μL的双色指示剂，用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色后,在胶片观察灯上观察拍照。

1.6 χ2测验

对F群体中青色叶片株数与紫色叶片的株数进行田间调查统计，卡平方测验公式如下：

1.7 连锁作图

将在亲本间具有多态性的引物对F代中隐性群体进行PCR扩增，将与Tx430条带一致的个体赋值为0，与IS31557一致的为2，双带为1。将群体基因型数据归类，用Mapmaker 3.0作图软件进行连锁分析，并用Mapchar作图。

2 结果与分析

2.1 IS31557和Tx430的表型及花青素含量分析

IS31557叶片为紫色，种子出苗后芽尖表现出紫色，叶尖、叶边缘颜色较深，叶脉为白色；Tx430叶片表现为绿色，叶脉为白色(图1)。

图1 IS31557和Tx430的表型

采用0.l mol/L盐酸对IS31557和Tx430叶片进行提取，IS31557提取液为红色，Tx430提取液为浅绿色(图2)。IS31557的含量为(2.56±0.45) g(10 mL 0.1 mol/L盐酸)，Tx430的含量为(1.64±0.52) g(10 mL 0.1 mol/L盐酸)，表明IS31557花青素含量显著高于Tx430(

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<0.05)。对材料IS31557采用不同光照强度处理，在7 000 lx处理下IS31557的含量为(2.00±0.31) g(10 mL 0.1 mol/L盐酸)，在2 400 lx光照强度处理下IS31557的含量为(1.22±0.04) g(10 mL 0.1 mol/L盐酸)，如图3所示，这说明7 000 lx处理下IS31557花青素含量显著高于2 400 lx光照强度处理下IS31557(

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<0.01)。因此，花青素的产生需要光的参与。

图2 花青素的提取液

图3 花青素含量比较

2.2 高粱紫色叶片基因遗传分析

以IS31557与Tx430进行杂交，F代叶片全部表现为紫色，这表明紫叶基因为显性遗传。随机调查F代299株，发现紫色222株、绿色77株(表1),对紫叶与绿叶进行卡平方测验，符合孟德尔遗传分配比例 3∶1，因此高粱紫叶性状受 1 对等位基因控制。

表1 高粱PL1基因的χ2测验

2.3 IS31557和Tx430引物的筛选及连锁分析

利用250对SSR标记对定位群体亲本进行PCR扩增，结果有60对SSR能够揭示亲本间的多态性(图4)，多态性率为24%。

图4 IS31557和Tx430多态性引物筛选

用149株绿色高粱DNA与60对具有多态性的SSR引物与

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1基因连锁(图5)，在标记S241、GS3128、GS3152处，经Mapmaker分析，连锁距离分别为23.8、47.6、27.3 cM(图6)。利用已公布的高粱分子图谱中S241、GS3128、GS3152的标记对

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1基因进行连锁分析，对控制紫叶

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1这一基因进行定位，找到与其紧密连锁的分子标记，发现紫色叶片基因

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1初步定位到第3连锁群上。

图5 SSR标记S241在F2隐性群体中的部分扩增结果

图6 高粱紫叶PL1基因在第3连锁群上的遗传图

3 结论与讨论

张毅等和宋丰顺等在研究水稻性状过程中发现水稻的紫叶主要成分为花青素，并且证明了花青素的合成必须有光的参与。本试验发现IS31557在不同光照处理下，通过花青素含量比较，证实了花青素的合成受光照的影响。胡伟等研究水稻叶鞘颜色时，将控制叶鞘紫色PSH1基因初步定位在第1染色体。本研究对控制高粱紫叶

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1这一基因进行定位，找到与它紧密连锁的分子标记，将紫色叶片基因

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1初步定位到第3连锁群上。吴关庭等从早籼陆青早1号中诱变获得了紫叶突变体PLM12，遗传分析认为该紫叶性状属核遗传，由1对隐性主效基因控制。本研究发现控制高粱紫叶基因受1对等位基因控制，表现为显性遗传。

近年来研究发现，花青素具有很高的抗氧化活性和抗菌活性，是公认的可以清除人体内自由基的天然抗氧化剂。Seeram等研究发现花青素和黄酮醇以加和或协同方式作用，达到抑制癌细胞HT29和HCT116生长，细胞花青素不仅有抗氧化性还具有抗癌、抗突变、保护心血管等作用。王文帅等在研究水稻黄酮和花青素代谢过程中，证明了该基因通过影响花青素代谢途径和相关基因表达，调控紫稻中的花青素合成。花青素是通过莽草酸途径合成，来自于苯丙氨酸的三分子丙二酰辅酶A和来自于酪氨酸的一分子4-香豆酰辅酶A在查尔酮合酶(CHS)催化下生成柚皮素查尔酮，在酶的作用下生成为其异构体柚皮素，在羟化酶的作用下进行羟化修饰，产生二羟黄酮醇，经过还原酶的催化生成无色花色素，在花青素合成酶的作用下发生糖基化反应，生成花青素。高粱中关于花青素的研究还未见相关报道，如果定位出控制高粱紫色叶片的基因，对高粱中花青素代谢途径展开深入研究，则可以利用叶片颜色来实现高粱品种的纯度鉴定，实现其方法的经济性和高效性，同时还可以通过工业化继续开发并应用于医药、食品、化妆、保健等领域。