徐玉亭，乔 晨，何思颖，董世栖，徐云峰，严 明

0引言

翼状胬肉系角膜缘结膜上皮细胞异常生长和分化所致，其发生发展是一个复杂的过程，涉及细胞增殖、迁移、炎症浸润、纤维化、血管生成和细胞外基质分解[1]。最新研究表明，上皮细胞间充质转化(epithelial mesenchymal transitios，EMT)可能在翼状胬肉的发病机制中发挥关键作用[2-3]。microRNA(miRNA)是一类小分子非编码RNA，可与靶基因mRNA的3’-UTR 通过完全或非完全碱基互补配对原则结合，进而发挥降解或抑制靶基因mRNA的作用，藉此参与调控机体的生长发育。近年越来越多的研究发现miRNA在人类的多种疾病中起着重要的调控作用[4]。目前已经证实，在翼状胬肉中差异表达的miRNA有35个，其中有16个表达升高，19个表达降低[5]，这些miRNA均对翼状胬肉的生长和分化发挥重要调控作用。研究发现miR-486-3p可通过靶向潜在靶基因对疾病的特定通路进行调控，已有研究证实胶质母细胞瘤[6]、肺癌[7]、膀胱癌[8]、宫颈癌[9]等多种疾病中miR-486-3p异常表达，其中miR-486-3p参与了肿瘤的增殖、生长和转移等病理过程。翼状胬肉头部向角膜侵入性生长在某种程度上与膀胱癌及宫颈癌的侵袭式生长类似[10]，据此，我们推测miR-486-3p可能同样参与了翼状胬肉的疾病进程。本文拟对翼状胬肉组织中miR-486-3p的表达情况及其潜在靶基因进行检测和生物信息学分析，寻找miR-486-3p在翼状胬肉发生发展中可能的作用机制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1研究对象及取材选取2018-09/2019-12在武汉大学中南医院和武汉爱尔眼科医院就诊的初发型翼状胬肉患者69例69眼，其中男30例，女39例；左眼32眼，右眼37眼；平均年龄61.890±1.315岁。纳入标准：(1)确诊为原发性翼状胬肉；(2)均为汉族，无血缘关系；(3)无其他眼部疾病及眼部手术史。排除标准：(1)复发性翼状胬肉；(2)合并眼部严重外伤、眼部感染、白内障、青光眼、急性泪囊炎等病史；(3)合并严重精神疾病者。收集术中切除的鼻侧结膜下增生翼状胬肉组织和术眼颞侧健康结膜组织，取材大小1.5mm×1.5mm。本研究经武汉大学中南医院伦理委员会审核批准，并经患者及家属知情同意。

1.1.2主要试剂及仪器低温离心机(中国湘仪集团)；CFX96荧光定量PCR仪、普通PCR仪(美国Bio-Rad公司)；RNA保护剂(RNAlaterTM，美国SIGMA公司)；Trizol Reagent、逆转录酶试剂盒(miRNA 1strand cDNA Synthesis Kit)；Cham QTMUniversal SYBR®qPCR Master Mix(中国南京Vazyme公司)；miRNA-486-3p及U6 逆转录引物均由中国武汉天一辉远有限公司合成。

1.2方法

1.2.1组织RNA提取术中采集标本并立即置于RNA保护剂(RNAlaterTM)中，存放于-20℃中。取标本组织60～100mg，用研磨棒研磨彻底，加1mL Trizol，匀浆彻底，转至EP管，颠倒上下混匀10下，室温搁置5min。加入1/5体积氯仿(约0.2mL)，充分颠倒混匀15s，室温异丙醇，混匀后-20℃放置1h(或室温下放置20min)。4℃下12000r/min离心10min，弃上清，加入(-20℃)预冷的75%乙醇1mL混匀，4℃下7500r/min离心5min，弃上清。开风机干燥20～30min(不能完全干燥)，加入30μL DEPC水，于55℃～60℃水浴8～10min，溶解后测浓度，存于-80℃。

1.2.2逆转录及荧光定量miR-486-3p相对表达量测定按照miRNA 1strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的步骤对所提取的RNA逆转录为miR-486-3p，每个样本均独立重复实验2次。按照Cham QTMUniversal SYBR®qPCR Master Mix的要求以2.5μL cDNA配制RT-PCR体系，按如下条件进行 PCR反应：95℃进行预变性30s，变性95℃ 3～10s，退火延伸60℃ 10～30s，扩增40个循环。以U6基因作为校正基数，△Ct=目的基因Ct值-U6基因Ct值，采用2-△Ct法计算miR-486-3p的相对表达量。miR-486-3p逆转录引物序列：Forward 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’，Reverse 5’-TCGCACTGGATACGACATCCTGTA- 3’；U6内参逆转录引物序列：Forward 5’- CTCGCTTCGGCAGCACA- 3’，Reverse 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3生物信息学分析采用Targetscan 7.1数据库(http：//www.target-scan.org/)、miWalk3.0数据库(http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRDB数据库(http：//www.mirdb.org/)分别对miR-486-3p进行靶基因预测，取3个数据库所得到的靶基因交集作为miR-486-3p的潜在靶基因；采用DAVID数据库(https：//david-d.ncifcrf.gov/)对miR-486-3p潜在靶基因进行功能富集分析[GO(gene ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路分析]；采用String网站对miR-486-3p的靶基因进行互作分析(protein-protein interaction，PPI)。

2结果

2.1翼状胬肉与正常结膜组织中miR-486-3p的表达RT-PCR检测结果显示，翼状胬肉组织中miR-486-3p相对表达量[(6.183±1.366)×10-6]与正常结膜组织中miR-486-3p相对表达量[(7.930±1.394)×10-5]有显著性差异(t=9.363，P<0.0001)，见图1。

图1 翼状胬肉与正常结膜组织中miR-486-3p相对表达量(Log10) bP<0.01 vs 正常结膜组织。

2.2生物信息学分析结果

2.2.1 miR-486-3p潜在靶基因在Targetscan 7.1数据库中将物种设置为Human，对miR-486-3p的靶基因进行预测，发现共4 472个靶基因；在miRDB数据库中对人miR-486-3p靶基因进行预测，发现共879个靶基因；在miWalk3.0数据库中筛选，得到人miR-486-3p潜在靶基因7088个。通过“http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/”网站绘制Venn图，如图2所示，得到 3个数据库交集靶基因436个，这些潜在靶基因在细胞内的信号传导通路中具有重要作用。

图2 miR-486-3p潜在靶基因Venn图。

2.2.2 miR-486-3p潜在靶基因的GO及KEGG通路分析miR-486-3p的潜在靶基因功能GO分析发现其主要生物学功能(biological process，BP)有221条，主要富集于RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调控，囊泡介导的转运、转录调控，DNA依赖性RNA代谢过程的调控等过程中；细胞组分(cellular component，CC)主要富集于质膜部分、突触小体、网格蛋白包被的囊泡、细胞连接、包被的囊泡等；分子功能(molecular function，MF)主要富集于转录因子活性、转录调节活性、转录阻遏物活性、转录因子结合、序列特异性DNA结合等，见图3A。KEGG通路分析气泡图显示，miR-486-3p的靶基因主要富集于神经轴突导向(Axon guidance)通路及溶酶体(Lysosom)通路上,见图3B。

图3 miR-486-3p潜在靶基因功能富集及途径分析 A：miR-486-3p潜在靶基因功能富集直方图，其中BP表示生物学功能，CC表示细胞组分，MF表示分子功能；B：miR-486-3p潜在靶基因途径富集气泡图。

2.2.3潜在靶基因与miR-486-3p结合位点预测及与Axon guidance通路的关系利用Targetscan 7.1数据库对miR-486-3p及Axon guidance通路中的靶基因“SEMA6A、PLXNA1、LIMK1、PLXNA2、SEMA3G、MAPK3、SRGAP3、ABL1、EPHB2”进行检索发现，miR-486-3p与靶基因ABL1和PLXNA1有潜在的结合位点，且潜在靶基因ABL1和PLXNA1主要参与SLIT/Robo和SEMA3A(Semaphorin 3A)/PLXNA1(Plexin A1)等Axon guidance信号通路，见图4。

图4 miR-486-3p与靶基因ABL1、PLXNA1预测结合位点及Axon guidance通路图 A：miR-486-3p与靶基因ABL1、PLXNA1预测的结合位点；B：Axon guidance通路图。

2.2.4 miR-486-3p潜在靶基因的PPI网络分析通过String网站对miR-486-3p的436个潜在靶基因进行分析得到PPI网络，采用Cytohubba插件对网络的基因互作进行计算分析，根据Degree值进行排名，按照Degree值取排名前50的关键基因重新构建网络图，发现Degree值较高的基因分别是MAPK3、STAT3、GRIN1、SYK、ABL1，表明这些基因可能与翼状胬肉的发生、发展有着重要关系，同时发现Axon guidance通路中的关键基因ABL1、PLXNA1也分别在Degree值前50的PPI网络中起着重要的连接作用，见图5。

图5 miR-486-3p靶基因的PPI网络图 A：PPI网络图前50个Hub基因(按照Degree排名)，颜色越深表示其Degree值越大；B：前20个基因的条形图。

3讨论

翼状胬肉的发生与紫外线照射、长期炎性因子刺激等因素导致的结膜下血管及纤维组织向角膜侵入性生长有关。研究发现翼状胬肉主要表现为结膜下血管及纤维组织增生，其中结膜下纤维组织增生的机制主要与EMT有关，结膜下新生血管形成的机制主要与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有关[11]。

Axon guidance通路即轴突导向通路，神经轴突到达相应靶组织的发育过程中，依赖周围环境中具有吸引和排斥作用的导向因子[12]。导向因子与相应的膜受体结合，通过 Ca2+、cAMP、Rho GTP酶信号通路最终引起细胞骨架向相应方向延伸[13]。目前已证实轴突导向因子除了引起神经系统发育外，还参与多种神经系统外的疾病进程，如目前研究较多的神经导向因子Semaphorins、Netrins、Slits家族[14]，其与新生血管的生成有着密切联系[15]。研究发现神经导向因子Netrin-1因子对多种肿瘤血管的发生、胎盘血管的生成、角膜及视网膜新生血管的生成具有重要的调控作用[16]，神经导向因子Slit通过Slit/Robo信号通路对多种肿瘤及视网膜新生血管均有调控作用[17]，有学者发现Slit2/Robo4蛋白网络通过抑制VEGF诱导新生血管形成和血管的渗透作用。神经导向因子SEMA因子家族不仅与神经系统、免疫系统、新生血管生成及多种肿瘤的发生及侵袭有密切联系[18-19]，其家族成员Sema3A可以与VEGF 165竞争NP-1的结合位点从而调节VEGF 165活性，而VEGF 165是血管系统发育早期的重要分子[20]。

目前，翼状胬肉的治疗手段主要是手术切除，但术后高复发率导致了手术的局限性，寻找新的治疗方式成为翼状胬肉治疗的研究热点。miRNA是一类长度为17～22个核苷酸的单链非编码小分子，通过与mRNA的互补序列结合调节基因的表达进而实现对机体生长发育、疾病发生发展的调控[21]。miRNA具有明显促进血管新生、促进角膜EMT[22-23]和增加基质成纤维细胞数量的功能[2，24]，其与翼状胬肉的严重程度和疾病进展密切相关[25]。因此，寻找与翼状胬肉相关的miRNA及其靶基因，阻断其靶基因的作用通路，有望成为小分子药物治疗翼状胬肉的研究基础。

miRNA-486-3p已被证实参与多种癌症的发展，但其与翼状胬肉的作用关系尚无相关研究。本研究采用基础研究与生物信息学相结合的方式对miRNA-486-3p及其潜在靶基因进行深入分析，发现miRNA-486-3p在翼状胬肉组织中表达明显降低，其潜在靶基因功能主要富集在转录、囊泡的转运等生物学功能上，其KEGG通路主要富集在Axon guidance、溶酶体等通路上，其中Axon guidance通路最具有显著性意义。本研究通过Targetscan数据库对miR-486-3p和ABL1、PLXNA1的靶点进行预测，发现其有潜在结合位点，进一步提示miR-486-3p可能通过靶向ABL1和PLXNA1对Axon guidance通路中的SLIT1/Robo和SEMA3A/PLXNA1通路来影响血管内皮细胞的骨架延伸方向，从而对翼状胬肉的血管生成发挥作用。PPI网络分析发现ABL1和PLXNA1在Degree排名前50的潜在基因中起着重要的关联作用，进一步证实ABL1和PLXNA1是通过调控Axon guidance通路中的SLIT1/Robo和SEMA3A/PLXNA1从而对翼状胬肉的发生、发展产生作用。

本研究结果表明，miR-486-3p在翼状胬肉组织中差异表达，miR-486-3p可能通过靶向神经轴突导向因子的受体干预受体与神经轴突因子结合，导致结膜下血管异常增生，从而影响翼状胬肉的发生和发展。本次研究发现翼状胬肉组织中miRNA-486-3p的表达量降低，并通对miRNA-486-3p靶基因的预测及通路分析发现神经轴突因子与翼状胬肉存在一定的相关性，该结果对阐明翼状胬肉的发病机制及治疗具有一定的创新性，为翼状胬肉的分子治疗提供了新的理论基础，但本研究尚需临床验证，有一定的局限性，研究结果有待进一步研究证实。