李伊宁，黄昆仑，姚志轶*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

叶酸，又称蝶酰谷氨酸，其化学结构由蝶啶基、对氨基苯甲酸残基和一个或多个谷氨酸残基构成（图1）[1]。 叶酸是一种水溶性VB，广泛存在于新鲜水果、绿叶蔬菜、动物肝脏和豆类中[2]。在人体中，叶酸参与氨基酸代谢与核酸代谢中一碳单位的获取、运输和酶促加工。有研究表明，叶酸可与VB12共同参与DNA和RNA的合成；同时，叶酸在RNA的转录中发挥重要作用，是DNA精确复制中必不可缺的关键因素[3-4]。由于人体无法自行合成叶酸，只能通过肠道吸收外源性叶酸，往往会导致叶酸缺乏症，而叶酸的缺乏会导致生理功能障碍和某些疾病的发生[5]，如巨幼红细胞贫血、精神退行性疾病、新生儿神经管畸形和骨质疏松等；因此叶酸的摄入与补充逐渐成为一个世界性的健康问题[6-7]，特别在中国，受叶酸摄入量影响的出生缺陷和慢性病也是一个重大的公共卫生问题[8-10]。2005年，国家公众营养改善项目办公室、国家发展和改革委员会公众营养与发展中心确定叶酸为“7+1” 面粉营养强化配方成分之一[1]。人们已经认识到叶酸的重要性，一些含叶酸的营养强化食品正不断地被开发[11]。而在医药体系中，叶酸是人体不可或缺的营养素之一，特别是孕妇、乳母、婴幼儿等有更强的叶酸补充需求[12]。

随着对叶酸研究的深入，越来越多的研究表明，通过食品强化途径摄入的叶酸也可能增加VB12缺乏的风险，进而使老年人罹患神经性疾病的概率增加[13]。也有研究指出，过量的叶酸可能导致缺锌、厌食、恶心等一系列胃肠综合症状[14]。因此，叶酸的合理摄入十分重要。快速准确地检测叶酸含量，是指导叶酸摄入并保证其安全性和有效性的重要技术手段，同时也是诊断各种疾病的有效指标[15]，对于临床诊断具有重要意义。

目前，许多叶酸检测方法已经被开发且日趋完善，传统的叶酸检测法包括微生物法[16]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[17]、液相色谱串联质谱法[18]、比色法[19]、毛细管电泳法[20]、酶联免疫吸附测定法[21]等。在已报道的方法中，微生物法因其测量范围广、成本低而被公认为首选方法，但其通常需要较长的检测周期。HPLC法与液相色谱串联质谱法具有良好的选择性，但在分析过程中仍存在设备昂贵、耗时长等问题。毛细管电泳法具有样品量少、分离效率高的优点，但也存在重现性差、有机溶剂有毒等缺点。此外，比色法和酶联免疫吸附测定法在检测时速度较快，但通常灵敏度较低，需要进行预处理以去除基质中的干扰。在此基础上，为了能够简便且精确地进行叶酸检测，人们开发了不同的检测叶酸的荧光传感器。

荧光传感器是指以荧光为手段，能够对检测物质产生可检测信号的策略或装置，一般由接受体、连接体和发光体组成，通过接受体与目标物的特异结合实现对后者的定性或定量检测[22-23]。相比于传统检测方法，荧光传感器具有操作简便、响应快速、灵敏度高、成本低等优点[24]。荧光传感器有诸多分类标准，如组成材料、待测物种类、信号的产生和传导机理等[25-26]。

本文对用于叶酸检测的荧光传感器组成材料进行分类，综述了不同类型传感器的研究进展，着重概述了用于叶酸检测的荧光传感器构建及其在食品、药品及生物方面的应用情况，以期为建立精准测定各种体系中叶酸含量的方法提供参考。

1 用于叶酸检测的荧光传感器构建

叶酸分子含有多种官能团，羧基、氨基赋予了叶酸的亲水性，蝶啶环、苯环赋予其疏水性，叶酸还有包括多个氢键的供体与受体，这些结构特点都为叶酸传感器的设计提供了基础。

1.1 基于有机分子探针的荧光传感器

有机分子探针往往具有广泛的原料来源和较强的结构可塑性，能够在不同的检测环境中根据需求进行多样化的设计，甚至无需辅助荧光增强即可达到较好的效果[27]。

2008年，Yao Zhiyi等设计合成了可作为检测叶酸用探针的聚(3-烷氧基-4-甲基噻吩)（poly (3-alkoxy-4-methyl thiophene)，P3RO-4MeT）（图2A）[28]。P3RO-4MeT是一种水溶性聚噻吩衍生物，具有荧光信号放大效应、优良的半导体性能和高摩尔消光系数等传统共轭聚合物的共同优势，且有着较好的环境稳定性与热稳定性。当P3RO-4MeT所在体系中加入叶酸时，由于静电作用和疏水作用的协同作用，叶酸能够诱导P3RO-4MeT形成超分子聚集体，进而发生明显的荧光猝灭，检测限为10 nmol/L。 此外，该过程的发生还伴随显著的颜色变化（图2B），为叶酸的可视化检测提供了思路。2019年，Jiang Shengjie等报道了一个基于聚集诱导发光机理用于检测叶酸的荧光探针——冠醚桥联双四苯乙烯（crown ether-bridged bis-tetraphenylethylene-1，Bis-TPE-1）（图3）[29]。 聚集诱导发光机理是由唐本忠院士在2001年提出的，即染料分子处于分散态时荧光强度较弱，甚至难以观察，但当其处于聚集态时荧光强度发生明显增强[30]。在测试体系（V（四氢呋喃）∶V（H2O）＝5∶95）中，分散态的 Bis-TPE-1由于分子内单键旋转而消耗能量导致其荧光微弱[29]。 加入叶酸后，叶酸的—NH2基团与Bis-TPE-1的C＝O 基团形成氢键，同时Bis-TPE-1的四苯乙烯与叶酸发生π-π作用。因此，叶酸位于两个四苯乙烯单位之间的空腔中，使得Bis-TPE-1分子内单键旋转被抑制而发出强烈的荧光，检测限为0.636 μmol/L。Jiang Shengjie等还制作了Bis-TPE-1试纸对其进行应用性能评估，发现在365 nm波长的紫外光照射下，除叶酸外其余物质均无变色[29]。

图 2 P3RO-4MeT分子结构式（A）和P3RO-4MeT探针加入 等浓度的各种待测物后的可视化响应（B）[28]Fig. 2 Chemical structure of poly (3-alkoxy-4-methyl thiophene) (A) and visual changes of poly (3-alkoxy-4-methyl thiophene) in the presence of substances to be analyzed at a molar ratio of 1:1 (B)[28]

图 3 Bis-TPE-1分子结构式[29]Fig. 3 Chemical structures of crown ether-bridged bis-tetraphenylethylene-1[29]

由于普通有机染料在水溶液体系中存在聚集猝灭效应，使有机分子荧光传感器在水溶液体系中的叶酸检测十分受限[29]。以上两种传感器均实现了水溶液体系的叶酸检测，无需添加辅助荧光增强的物质即可达到强烈荧光及颜色变化，有效地实现了叶酸检测，但目前基于有机分子探针的荧光传感器报道依然较少，有待于进一步研究。

1.2 基于发光配合物的荧光传感器

配合物是一种以金属离子为中心，有机配体通过配位键与其发生自组装的无机-有机杂化材料[31]。由于其集合了无机材料和有机材料的特点，且它的结构与性质更加易于调控，所以其被认为是一种应用前景广阔的材料。

在以配合物为荧光探针检测叶酸时，荧光发生猝灭的最主要原因是结构坍塌机理，即配合物的空间结构在识别叶酸的过程中被破坏而导致荧光猝灭[32]。

Yu Fengshan等设计了Tb3+-氧四环素（图4A）作为荧光探针并以其进行叶酸的检测[33]。Manzoori等选择 1,10-邻二氮菲作为Tb3+的配体进行检测（图4B）[34]。氧四环素与1,10-邻二氮菲均能够将吸收的能量传递给 Tb3+，从而提高其荧光强度。有研究表明，芳香羧酸配体和β-二酮配体在发生分子内能量转移时具有较高的能量传递效率[35]。当加入叶酸后，上述两种荧光探针的配体（氧四环素和1,10-邻二氮菲）均通过非共价作用与叶酸形成稳定、结合度高且结构刚性好的基态络合物，使荧光探针发生猝灭。Alam等报道了以Eu3+为配位中心的荧光探针（图4C）[36]。由于Eu本身荧光较弱，因此选择了依诺沙星作为配体与其络合。依诺沙星因结构中含有—COOH和C＝O两种活性基团，能够与Eu3+形成强络合物而使荧光强度增强[37]。在碱性介质中，叶酸能够引起该探针的荧光猝灭，线性范围为1.25～150 nmol/L，检测限为0.694 nmol/L。

综上所述，基于配合物的荧光传感器往往通过有机配体与稀土离子相互作用，使其荧光增强。这使得以上荧光传感器避免了来自生物基质的荧光干扰，可以在高效 灵敏地测定叶酸含量的同时降低共存物质的干扰，使检测拥有良好的抗干扰能力。

图 4 发光配合物探针示意图[33-34,36]Fig. 4 Schematic illustration of luminescent probes[33-34,36]

1.3 基于纳米材料的荧光传感器

纳米荧光传感器往往具有光学性能稳定、量子产率高、生物相容性良好等优点。由于纳米粒子的尺寸和组成使得纳米荧光传感器在特定能级下发光，其在单一激光源的激发下可以得到不同的颜色[38]，因此纳米荧光传感器可以同时检测多个光学信号，使其应用更加灵活。

1.3.1 基于量子点的荧光传感器

量子点是近年来最具发展潜力的新型纳米材料之一，因其特殊的结构和良好的性能而广受关注。量子点具有宽且连续的激发光谱、窄且对称的发射光谱、高而稳定的发光效率、非常强的抗光漂白能力以及良好的生物相容性[39]，同时它具有大的斯托克位移，可以显著避免荧光发射和激发之间的光谱重叠[40]。因此，量子点的应用可以提高荧光信号的检测灵敏度和稳定性。

Chen Zhangbao等以乳糖作为碳源，通过水热合成法在强碱（NaOH溶液）环境中合成了具有蓝色荧光的碳量子点（图5）[41]，叶酸的亲水官能团可以与碳量子点表面的亲水基团形成氢键，使碳量子点发生聚集，进而导致其荧光猝灭。张毅等采用聚乙烯亚胺使量子点功能化[13]。 由于聚乙烯亚胺的引入，量子点表面拥有了大量的氨基。当叶酸加入检测体系后，叶酸的羧基会与量子点表面的氨基发生静电作用，进而导致电子转移，使量子点发生荧光猝灭。以上两种均是采用发光量子点的单发射波长的传感器，这类传感器的研究极为丰富[42-45]，研究者们往往通过合成技术控制量子点的尺寸及其化学组分，来实现量子点在检测过程中的优化。

此外，有研究者通过对发光量子点的修饰实现了双发射比率荧光传感器的构建，这在叶酸检测的传感器中较为少见。Wang Yongbo等设计了以铜、锰共同掺杂的ZnS量子点为荧光探针的比率荧光传感器，以595 nm波长和490 nm波长处两个发射峰比值作为检测叶酸浓度的指标（图6）[46]。叶酸可以与铜、锰共同掺杂的ZnS量子点通过静电作用发生强烈相互作用，且叶酸的羧酸基团和氮原子对量子点表面的锌具有很高的亲和力。因此，在铜、锰共同掺杂的ZnS量子点表面可以很容易地吸附叶酸，并实现叶酸的检测，线性范围为0.01～5 μmol/L， 检测限为6 nmol/L。He Yu等将氨基修饰的橙色量子点与 羧基修饰的蓝色石墨烯量子点（graphene quantum dots，GQDs）共价连接，制备了一种双发射纳米探针（图7）[47]。 当激发波长为310 nm时，该探针在401 nm波长和605 nm波长处有两个发射峰，其比值与体系中叶酸浓度存在线性关系。叶酸可以通过静电作用吸附在量子点表面，同时叶酸的亲水基团与GQDs的亲水基团形成氢键，使发光量子点发生荧光猝灭。该方法检测范围为0.25～51.34 μmol/L，检测限为0.03 nmol/L。这两种传感器由于在检测时计算两个发射强度的比值，具有自参考能力，可以减轻环境影响，使检测更加灵敏准确[46]。

图 5 碳量子点合成示意图[41]Fig. 5 Schematic illustration of synthesizing carbon quantum dots[41]

图 6 基于铜、锰共同掺杂ZnS量子点为探针的比率荧光传感器[46]Fig. 6 Schematic illustration of ratiometric fluorescent sensors based on Cu-Mn codoped ZnS quantum dots[46]

图 7 基于双发射纳米探针的比率荧光传感器[47]Fig. 7 Schematic illustration of ratiometric fluorescent sensors based on a dual-emission fluorescent nanoprobe[47]

1.3.2 基于金属纳米簇的荧光传感器

荧光金属纳米簇是近年来新兴起的一类发光材料，包括几个至几百个金属原子[40]。金属纳米簇与其他材料相比，粒径小、毒性低、生物相容性好。但是，由于荧光量子产率较低，限制了其在传感应用中的使用[48]。 因此，学者们寻找了许多有效的手段来提高其荧光量子产率。

在叶酸的传感检测中，学者们以纳米簇作为构筑基元，通过有效的超分子相互作用构筑组装体，以增强纳米簇的荧光性能。Zhang Jianrong等应用聚乙烯亚胺包封银纳米团簇（polyethylenimine-capped silver nanoclusters，PEI-AgNCs）[49]。PEI与叶酸也可发生相互作用，使叶酸与AgNCs更加靠近，进一步加强了二者之间的静电作用。在体系中，电子可以通过PEI由叶酸转移至AgNCs使其发生荧光猝灭，检测限为0.032 nmol/L。Li Xinge等采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）与铜纳米簇（CuNCs）相互作用并作为荧光探针（图8）[24]。OVA含有丰富的氨基酸残基，因此OVA表面众多羧基可以与铜原子相互作用，进而与铜纳米簇形成OVA-CuNCs。叶酸可以通过静态猝灭机制使OVA-CuNCs荧光发生猝灭，进而实现叶酸检测，检测限为0.18 μmol/L。Yan Xu等提出了应用金属纳米簇的另一种策略：在体系中同时引入金纳米团簇（AuNCs）和巯基乙胺修饰的金纳米颗粒（cysteamine-modified gold nanoparticles，cyst-AuNPs）[50]。

AuNCs的荧光可以被cyst-AuNPs猝灭，但在加入叶酸后其荧光得以恢复。这可能是由于叶酸吸附在 cyst-AuNPs表面使其聚集，或者叶酸通过氢键将相邻两个 cyst-AuNPs的羧基和氨基连接，同时通过静电作用使其聚集。因此，加入叶酸后，可以通过AuNCs的荧光增强实现对叶酸的检测，检测限为0.065 μmol/L。

图 8 基于OVA-CuNCs的荧光传感器[24]Fig. 8 Schematic illustration of fluorescent sensors based on ovalbumin-CuNCs[24]

在上述采用金属纳米簇的荧光传感器中，叶酸与PEI-AgNCs需要反应20 min以达到最大荧光猝灭效率，而其与AuNCs/cyst-AuNPs需要反应15 min以达到最大荧光猝灭效率。这表明大多数采用金属纳米簇的荧光传感器在进行叶酸检测时需要一定的反应时间，未来一段时间内，进一步缩短检测时间、提升检测效率或成为该方向的研究重点。

1.3.3 基于片层纳米材料的荧光传感器

众所周知，溶液中的有机发色团在长时间的使用过程中，通常会受到活性物质的浸出或降解，从而导致 荧光猝灭。为了针对复杂体系建立更加稳定的叶酸检测方法，学者们研究了新型纳米传感器。

Liu Pengfei等将8-氨基萘-1,3,6-三磺酸盐（8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate，ANTS）固定在层状双氢氧化物（layerd double hydroxides，LDH）表面，研制了一种新型的荧光纳米传感器[51]。LDH具有刚性的主体层板、良好的光热稳定性和紫外阻隔等优点，LDH薄膜基荧光材料目前已经被广泛运用到各类荧光传感器中[52]。在LDH表面被ANTS锚定的—SO3中的氧原子很容易与叶酸发生碰撞并形成氢键，导致 ANTS-Zn-Al-CO3-LDH的荧光猝灭（图9）[51]。该传感器在模拟生理条件下，线性范围为1～200 μmol/L，检测限为0.1 μmol/L。

图 9 基于ANTS-Zn-Al-CO3-LDH的荧光传感器[51]Fig. 9 Schematic illustration of fluorescent sensors based on 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate-anchored Zn-Al-CO3-layerd double hydroxides[51]

为更直观地进行性能对比，将上述传感器优点、缺点及检测机理总结为表1。目前，针对检测叶酸的荧光传感器构建均基于叶酸与传感材料之间的非共价作用所导致的荧光信号改变。信号改变在单发射波长传感器中主要为荧光猝灭或荧光增强；在双发射比率荧光传感器中为发光材料两发射峰比值发生改变。

表 1 检测叶酸的不同材料传感器特点Table 1 Features of various sensors based on different sensing materials for folic acid detection

2 检测叶酸的荧光传感器应用进展

利用荧光检测快速、灵敏、简便的优点，检测叶酸的荧光传感器可以在食品安全、生理生化检测以及临床诊断等诸多领域中发挥功效。

2.1 食品药品质量控制

随着人们生活品质的提高及营养知识的普及，选择添加营养补充剂的食品来弥补原本膳食中摄入不足的叶酸成为热点[53]。同时，叶酸药品及保健品的开发也拥有非常广阔的市场前景。

Blanco等采用荧光素建立了检测叶酸的荧光传感器并在某运动饮料中进行了实际检测[54]。随着研究的不断深入，针对叶酸制剂、面粉及制品、奶制品、蔬菜、饮料等多种体系检测叶酸的荧光传感器的应用有诸多报道。Hassanzadeh等设计了一种基于纳米银增强铽荧光强度的新型荧光探针，该探针可以与叶酸形成三元复合物导致荧光猝灭[55]。在实际应用中进行药片及面粉中的叶酸检测时，加标回收率在97%～102%之间，且与HPLC法检测结果相近。Li Xinge等在食品、药品体系中应用OVA-CuNCs荧光传感器[24]。在检测过程中，OVA可以保护CuNCs在一定程度上免受pH值、温度、阴离子干扰等影响。

2.2 临床检测评估

叶酸缺乏与多种临床表现有关，因此准确地评估人体内叶酸的状态非常重要。目前，血清叶酸和红细胞叶酸检测在临床实验室中较为常见，其中，血清叶酸可反映体内叶酸的短期水平，因而能够更及时地体现疾病的发生与发展[56]。

图 10 Fe3O4-ZnS:Mn2＋/SiO2-NH2纳米复合材料的荧光传感器[57]Fig. 10 Schematic illustration of fluorescent sensors based on Fe3O4-ZnS:Mn2+/SiO2-NH2 nanocomposite[57]

为了实现临床中快速准确的检测，学者们在尿液[14]及血清[50]中应用传感器进行实际检测。Chakravarty等设计了以聚乙烯醇为基底的色氨酸-碲化镉量子点纳米荧光传感器[4]。该传感器被应用于经过血浆蛋白去除的急性骨髓性白血病患者与卵巢癌患者血清样品，表现出很高的传感效率，检测限分别为95.81 nmol/L与826.91 nmol/L。 Li Xiaowan（图10）[57]和Wang Meng[58]等均在其传感体系中加入磁性纳米颗粒作为吸附剂进行检测。作为吸附剂的磁性纳米粒子在水溶液中有独特的分散能力，与样品溶液之间的接触比表面积极大，可以高效地吸附样品。与传统样品前处理方法相比，磁性纳米粒子可以在外加磁场的条件下更容易与血清基质分离，无需额外的过滤和离心步骤即可进行检测，更加方便、经济、高效。因此，该磁性复合荧光材料可以更直接地用于复杂生物血清样品的检测，促进了叶酸临床检测评估的发展。

2.3 细胞成像

荧光传感器拥有良好的发光性能，因此，基于荧光探针的生物成像技术拥有巨大的潜力[59]。研究者们设计了一系列生物相容性良好且毒性低的荧光探针，以此探究生物体内微环境并实现对疾病的可视化评估。

Jiang Shengjie等研究发现含有荧光探针Bis-TPE-1的细胞呈现出绿色荧光，当加入叶酸后该荧光变为蓝色，这说明Bis-TPE-1有良好的生物成像能力[29]，可以用于检测人体环境中的叶酸。Mu Zhao等制备了氮、硫、碘共同掺杂的荧光碳点（N, S, I co-doped carbon dots， N, S, I-CDs），该荧光碳点具有良好的稳定性、亲水性、低毒性和良好的生物相容性[60]。对U-2OS和结肠癌细胞HT-29的成像实验结果表明，N, S, I-CDs在体内外均可用于叶酸和温度传感，是良好的细胞显像剂。

图 11 荧光探针AA-CDs叶酸检测及其用于癌细胞靶向检测示意图[62]Fig. 11 Schematic illustration of AA-CDs for the detection of folic acid and fluorescence targeted imaging of folate receptor overexpressed cancer cells[62]

癌症严重威胁着人类的健康和生命，其早期的诊断目前被视为世界性的重大医学难题。光学成像技术作为一种新兴的影像技术，在灵敏度和分辨率方面均有巨大的优势，能够为寻找有效的癌症早期诊断办法奠定 基础[61]。Qian Jiali等由抗坏血酸（aconitic acid，AA）与碳量子点通过水热反应合成了荧光探针AA-CDs，该探针可与叶酸形成三元复合物，导致荧光猝灭[62]。FA-AA-CDs 被认为是一种弱荧光纳米探针，可以被细胞表面的叶酸受体识别。当AA-CDs被释放到细胞内后发出荧光，这一动态过程有利于对叶酸受体过度表达的癌细胞进行靶向检测，并依据细胞荧光强度区分叶酸受体表达水平 不同的细胞（图11）[62]。Kundu等采用多价树枝状 高分子-半导体纳米复合材料，增强了探针与叶酸受体的结合程度，可作为显像剂对细胞表面叶酸受体进行 检测[63]。同时，该研究中的叶酸-多按树突状分子偶联物也为开发针对癌细胞的药物传递系统提供启发，为药物靶向输送奠定基础。

3 结 语

综上，尽管基于荧光信号的叶酸传感器数量不多，但其发展已经趋于成熟。目前，各种各样的材料都被用于构建检测叶酸的荧光传感器，检测材料覆盖了有机分子探针、发光聚合物和纳米材料。采用荧光传感器的叶酸检测方法最低检测限可达到0.03 nmol/L，可操作范围覆盖0.1～200 μmol/L，已在食品、药品、血清、尿液等多种实际样品或环境中进行应用，抗干扰性良好。然而针对叶酸与探针的结合常数鲜见报道，这或许是后续工作中评价叶酸检测特异性及抗干扰能力的客观指标之一。可见荧光传感器已成为快速、灵敏、简便的理想叶酸检测方法之一，极大地促进了叶酸检测技术的发展。

随着检测需求日益增多以及叶酸标准化检测需求的增加，检测叶酸的传感器依然面临着巨大的挑战：1）食品基质十分复杂，实际样品体系中可能存在多种干扰物的协同效应。为提升实际样品检测中的准确性，增加协同干扰测试、提升传感器抗干扰能力或优化检测前处理方法等将有效提高叶酸在复杂体系中的检测能力；2）生理条件下，叶酸有不同的存在形式，在医学检测中各种存在形式的叶酸均需纳入检测范围；3）目前叶酸的检测与应用主要在水溶液体系中进行，为了增强检测的便利性，应考虑更加便携、直观的检测模式；4）目前针对检测叶酸的荧光传感器的研究方向较为单一，多集中于采用纳米量子点的传感器，且大多采用荧光猝灭法、单发射波长表征的方式，因此，研制更加多样化的检测叶酸的荧光传感器是未来发展趋势。综上所述，检测叶酸的传感器展现出了极大的应用潜力和市场价值，随着进一步的开发，该方法有望在食品检测、生化检查、疾病诊断等多个领域投入生产和应用。