刘兴勇，陈兴连，杜丽娟，林 涛，尹本林，杨东顺，邵金良*，汪禄祥

（云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650205）

咖啡中绿原酸类化合物含量十分丰富，约占咖啡质量的6%～12%[1]，主要以绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸3 种异构体为主，三者在小粒种咖啡中占多酚总量的80%以上，其中绿原酸占62%左右[2-3]。绿原酸不仅具有抗氧化、抗菌、保护心脏和神经、调控糖脂代谢和抗肿瘤等生物活性[4-6]，最新研究表明绿原酸还可抑制高温加工食品中有害内源污染物丙烯酰胺和晚期糖基化终产物的产生[7-10]，是一种新型、天然、高效的食品污染物抑制剂和食品免疫增强剂[4,6]，其烘焙产物是咖啡苦味物质的来源之一[11]。

烘焙条件对咖啡豆的物理和化学性质有较大影响。Smrke等[12]报道咖啡中的新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的质量分数分别为0.17%～0.21%、2.9%～3.2%、0.28%～0.34%。Dong Wenjiang等[13]发现不同品种咖啡绿原酸含量无显著差异，而新绿原酸和隐绿原酸含量在品种间差异显著。近年来有许多关于烘焙条件对咖啡绿原酸影响的报道。绿原酸在咖啡烘焙过程中能发生酰基迁移、脱水、差向异构化及与醋酸、奎尼酸和莽草酸的酯交换，通过4 种不同的反应途径产生热降解，目前咖啡豆中共鉴定出137 种不同的绿原酸衍生物[14-15]。Moon等[16]指出咖啡总绿原酸含量随烘焙强度的增加而降低，230 ℃下烘焙12 min和250 ℃下烘焙21 min，绿原酸总含量分别降至原含量的50%和接近微量。该结果与本课题组前期研究结果[17]一致，且新绿原酸和隐绿原酸在轻度烘焙时含量较生咖啡豆有所上升，主要原因是绿原酸在一定条件下发生异构体的转化[18]。绿原酸先异构为隐绿原酸，然后经分子内酰基迁移生成新绿原酸，其异构化取决于基质的pH值和温度[19]。烘焙咖啡基质pH值偏酸性，在4～6之间[16]，有研究表明绿原酸在酸性条件下稳定[20]，但在咖啡烘焙高温条件下也能导致绿原酸异构体的转化。研究证明咖啡酸度也与绿原酸含量有关，烘焙后随酸度降低，绿原酸含量下降[16]。在咖啡烘焙过程的早期，高温下绿原酸一方面可发生差向异构化，产生 多种异构体；另一方面，通过水分子的损失和分子内酯键的形成而产生内酯，随着温度的升高，异构体及内酯含量逐渐增多，其中3-咖啡酰奎宁酸内酯和4-咖啡酰奎宁酸内酯是主要的绿原酸内酯，且轻度烘焙的内酯含量整体高于重度烘焙[20-21]。绿原酸的异构化和内酯的形成改变了异构体间的含量比例[22-23]，咖啡继续烘焙导致绿原酸及其内酯碳-碳键断裂，形成咖啡酸和奎宁酸、奎宁内酯类，逐步形成挥发性风味成分，如呋喃、吡啶、吡咯和吡嗪等[24]。因此，咖啡中绿原酸含量的高低与烘焙咖啡品质特性密切相关[25]。

除咖啡酰奎宁酸类绿原酸异构体，异绿原酸也是咖啡中含量较多的一类绿原酸异构体，包括异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C 3 种，其中异绿原酸A为主要成分，占生咖啡豆质量的0.5%左右，影响冲泡咖啡的可接受度[26]。异绿原酸类异构体间同样可发生转化，并生成相应内酯[23]，但鲜见该类异构体在咖啡烘焙中的相关转化研究。咖啡烘焙过程中，绿原酸能产生各种衍生物和挥发性成分，从而影响咖啡的品质、风味和口感。因此，开展绿原酸及其异构体在咖啡烘焙中的降解规律及影响因素的研究，对保持其功效活性、揭示咖啡化学成分和感官属性之间的相互关系及控制咖啡品质具有重要意义。本研究采用不同条件对小粒咖啡生豆进行烘焙，分析绿原酸及异构体与烘焙温度、时间和咖啡基质pH值的量效动态变化和转化关系，并采用动力学模型和化学反应模型探讨多重因素对绿原酸降解的交互作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮卡小粒生咖啡豆购于普洱金树咖啡产业有限公司。

绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸B、异绿原酸A标准品 成都德思特生物技术有限公司；甲醇（色谱纯） 德国Merck公司；磷酸、 磷酸氢二钠、柠檬酸（分析纯） 国药集团化学试剂有 限公司。

1.2 仪器与设备

PhSJ-5 pH酸度计 上海仪电科学仪器股份有限 公司；e2695高效液相色谱仪（在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、2998二极管阵列检测器） 美国 沃特世公司；Milestone ETHOS A微波消解/萃取系统 意大利莱伯泰科公司；CENTRA-R200超纯水制备系统 英国ELGA公司；T500电子分析天平 常熟市双杰测试仪器厂；BSA224S-CW电子分析天平 德国赛多利斯 公司；CBR-101咖啡烘焙机 韩国Gene Cafe集团。

1.3 方法

1.3.1 咖啡豆样品的烘焙

将200 g生咖啡豆放入烘焙机中，设定烘焙温度分别为230、235、240、245 ℃，烘焙时间分别为10、12、14、16、18 min。烘焙结束后迅速冷却、称质量，磨碎过80 目筛，密封锡箔纸保存于-20 ℃备用。

1.3.2 咖啡豆水分质量分数及烘焙质量损失率的测定

水分质量分数的测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》，采用直接干燥法。咖啡烘焙质量损失率按公式（1）计算。

1.3.3 咖啡pH值的测定

生咖啡豆和烘焙咖啡豆pH值测定参照Chindapan等[27]的方法。称取2 g磨碎并通过80 目网筛的咖啡粉放入250 mL锥形瓶内，加入100 mL蒸馏水，摇匀。将混合物在电热板上加热至微沸，并保持10 min，冷却后用滤纸过滤。取50 mL滤液至100 mL平底烧杯中，使用事先校正好的pH计测定pH值。

1.3.4 绿原酸降解模拟模型

采用不同比例的磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）和柠檬酸溶液（0.1 mol/L）配制pH值分别为4、5、6的缓冲液，利用上述缓冲液配制浓度为10 mmol/mL的绿原酸溶液。吸取2.0 mL绿原酸溶液加入石英管中，采用微波消解/萃取系统加热，温度分别设置为180、200 ℃， 加热时间分别为10、20 min，反应结束冷却后定容至2.0 mL，过0.22 μm滤膜，测定3 种绿原酸异构体含量。每份样品进行3 次平行实验。

1.3.5 咖啡中绿原酸类化合物含量的测定

称取0.5000 g（精确至0.0001 g）制备的咖啡粉于100 mL容量瓶中，加入80 mL体积分数0.1%的磷酸-水溶液，沸水浴30 min，期间每隔10 min摇动一次。取出冷却至室温，用体积分数0.1%的磷酸-水溶液定容并混匀，静置10 min后过0.45 μm滤膜，待测。新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸及3 种绿原酸异构体含量的测定采用高效液相色谱法，配备2998二极管阵列检测器；分离柱为CAPCELL PAK MG IIC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）和体积分数0.1%的磷酸-水溶液（B），流速为1.0 mL/min；进样体积10 μL；柱温35 ℃；检测波长327 nm。梯度洗脱程序为：0～10 min，10% A；10.01～12 min，20% A；12.01～30 min，20% A；30.01～32 min，10% A；32.01～36 min，10% A。

1.4 数据统计与分析

采用Graphpad Prism 8.0统计软件进行单因素方差分析（P＜0.05表示差异显著）、Pearson相关性分析，采用SPSS 20.0统计软件进行两因素交互作用分析。检测结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 咖啡烘焙给热曲线

230 ℃烘焙温度的咖啡烘焙给热曲线如图1所示，咖啡烘焙机给热可分为升温、恒温烘焙和降温3 个阶段。设定烘焙温度为230 ℃、烘焙时间10 min时，咖啡豆烘焙开始时，由室温升至设定温度，包括生咖啡豆蒸发水分并引起化学反应导致温度下降并逐渐上升，这一阶段大概持续3 min，恒温烘焙7 min，降温至60 ℃需9 min。以此类推，烘焙温度每升高5 ℃时，升温时间延长1.5 min，恒温烘焙时间延长2 min，降温时间延长1.5 min。咖啡烘焙给热曲线能为开展不同程度烘焙咖啡烘焙工艺和参数的设计提供参考。

图 1 咖啡230 ℃烘焙时给热曲线Fig. 1 Temperature-time curves of coffee roasting process at 230 ℃

2.2 不同烘焙程度咖啡豆质量损失率和水分质量分数

如图2所示，随烘焙时间的延长和烘焙温度的升高，小粒咖啡豆水分质量分数降低，从生咖啡豆的最高水分质量分数8.91%降至245 ℃烘焙18 min的最低质量分数5.62%。质量损失率变化趋势与水分质量分数相反，随着水分质量分数的减少，咖啡质量损失率增加。在0～10 min烘焙加热过程中，随烘焙温度升高，咖啡豆质量损失率急剧增加，在烘焙后期的14～18 min，质量损失率增加趋于 平缓。质量损失率范围在1.90%～3.29%，最低和最高质量损失率分别对应230 ℃烘焙10 min和245 ℃烘焙18 min。本研究显示，咖啡水分质量分数与烘焙时间、温度分别呈负相关，烘焙的强度显著影响咖啡水分质量分数和质量损失率，结果与Somporn等[28]研究一致，其指出水分的损失主要发生在咖啡烘焙的脱水阶段，裂解阶段有少部分损失，但非常缓慢。

图 2 不同烘焙程度咖啡水分质量分数（A）及质量损失率（B）变化Fig. 2 Changes in moisture content (A) and mass loss rate (B) of coffee at different roasting degrees

2.3 烘焙咖啡pH值及绿原酸类化合物含量变化规律

由表1可知，生咖啡豆pH值为5.71，相同烘焙温度下，随烘焙时间延长，pH值呈现先降低后升高的趋势。在相同烘焙温度下，230 ℃时烘焙12 min咖啡pH值最低，其余温度下最低pH值均出现在烘焙10 min时，随烘焙时间的延长，pH值逐渐升高，245 ℃烘焙18 min pH值升高至5.80。与pH值不同，绿原酸含量随烘焙时间的延长或烘焙温度的升高显著降低，230 ℃下烘焙10 min，含量降低为生咖啡豆的50%左右；同一烘焙时间，温度越高含量降幅越大，如235、240、245 ℃烘焙10 min，绿原酸含量分别为生咖啡豆中的41.7%、41.9%和31.4%，该结果与Moon等[16]的结论一致。烘焙时间对绿原酸影响明显，不同烘焙温度，相同的烘焙时间（0～10 min），绿原酸的含量显著变化（P＜0.05），在245 ℃烘焙18 min后绿原酸含量降至0.54 mg/g。异绿原酸异构体在生咖啡豆中含量较低。异绿原酸类异构体在230 ℃烘焙10 min时含量均显著降低（P＜0.05），12 min时出现不同程度的升高，其中异绿原酸A和异绿原酸C含量显著增加 （P＜0.05）。异绿原酸3 种异构体总体上随烘焙时间延长呈现降低趋势，但不同异构体含量降低程度没有一致规律。有研究表明，在热降解中，异绿原酸B比异绿原酸A更稳定，随烘焙时间的延长，二者比值也增加，可能是异构体在相互转化的同时异绿原酸A热降解速率更高所致[21]，在本研究中，异绿原酸B含量较其他两种异构体高，二者含量变化趋势与上述报道一致。

表 1 烘焙咖啡绿原酸异构体含量及pH值Table 1 Contents of chlorogenic acid and its isomers as well as isochlorogenic acids and pH in roasted coffee

如图3所示，绿原酸与烘焙温度、时间呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数分别为-0.800和-0.939，与咖啡水分质量分数极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.863，与咖啡pH值呈弱负相关。有研究报道，绿原酸在酸性条件下较稳定[20]，本研究结果显示生咖啡豆和烘焙咖啡豆pH值均处于酸性环境，该结果与Moon[24]、Chindapan[27]等的研究结果一致。酸性基质条件可在一定程度上缓解绿原酸的降解和转化。其次，水分的存在可缓解绿原酸的异构化和降解[21]，但绿原酸的热不稳定性仍可导致其快速降解。与绿原酸变化规律不同，新绿原酸和隐绿原酸在烘焙时间较短的情况下（10～12 min）较生咖啡豆含量有所增加。230～245 ℃下烘焙10 min，新绿原酸含量增加幅度分别为88.9%、66.3%、66.1%和21.5%；隐绿原酸含量增加幅度分别为82.7%、62.0%、61.7%和20.9%。可见，在同一烘焙时间，新绿原酸和隐绿原酸随烘焙温度升高，含量增幅逐渐降低。可能原因是绿原酸在烘焙初期除发生降解外， 还大量异构化为新绿原酸和隐绿原酸；随烘焙时间延长，pH值逐渐升高，两种异构体同时发生内酯化和降解，导致含量显著降低[18,21]。本研究发现两种异构体在245 ℃下亦出现快速降解，导致不同烘焙时间含量差异显著，研究结果与上述报道的结果[18,21]一致。由图3可知，新绿原酸和隐绿原酸均与烘焙时间呈显著负相关（P＜0.05），相关系数分别为-0.636和-0.641。有研究显示，新绿原酸和隐绿原酸两种异构体较绿原酸具有更好的耐热性，与烘焙时间的相关性更高[21]。本研究还发现新绿原酸、隐绿原酸与pH值呈极显著负相关 （P＜0.01），相关系数分别为-0.808和-0.811，pH值同样是影响绿原酸降解的重要因素之一。

图 3 烘焙咖啡影响因素与绿原酸类化合物含量相关性分析结果Fig. 3 Correlation analysis of roasting conditions and pH with contents of three caffeoylquinic acids in roasted coffee beans

2.4 绿原酸异构体随烘焙时间变化的降解动力学

为研究咖啡烘焙中绿原酸降解规律，采用无因次量C建立烘焙过程绿原酸降解动力学模型，C为某一烘焙条件下绿原酸含量与生咖啡豆绿原酸含量比值。零级反应动力学方程如式（2）所示。

一级反应动力学方程如式（3）所示。

式中：k为反应速率常数/min-1；t为干燥时间/min。

对不同烘焙温度、不同烘焙时间所得绿原酸、异构体含量变化进行曲线拟合，结果如图4和表2所示，lnC与时间呈良好的线性关系，R2均在0.96以上（表2），符合一级反应动力学模型。式（2）符合烘焙咖啡绿原酸异构体降解的动力学变化规律。本研究还发现异绿原酸3 种 异构体的变化趋势不适合用动力学模型拟合，可能其化学性质与绿原酸类异构体差异较大，且不能排除其可通过热降解而产生绿原酸类异构体[21]。综上，异绿原酸类的热降解较复杂，有待进一步研究验证。

图 4 不同烘焙温度下3 种绿原酸异构体的拟合曲线Fig. 4 Fitting curves for three caffeoylquinic acids at different roasting temperatures

表 2 不同烘焙温度下绿原酸降解模型及拟合参数 Table 2 Kinetic models and fitting parameters for degradation of three caffeoylquinic acids at different roasting temperatures

2.5 温度和时间交互作用对绿原酸含量和pH值的影响

由上述结果可知，并不是所有烘焙因素对绿原酸异构体均具有同样的作用效果，因此开展咖啡烘焙温度和时间的交互作用分析，结果如表3所示。咖啡烘焙中，3 种异构体含量快速降低，烘焙时间、温度、pH值等因素存在一定的交互作用，烘焙温度和时间的协同作用对3 种绿原酸异构体含量和咖啡pH值呈现高度 显著的影响（P＜0.001）。

表 3 咖啡烘焙温度与时间交互作用对绿原酸含量和pH值影响的分析Table 3 Analysis of variance for the effect of interaction between roasting temperature and duration on the contents of three caffeoylquinic acids and pH in roasted coffee beans

2.6 温度和pH值对绿原酸异构体含量的影响

采用准确控制pH值的绿原酸化学模拟反应模型验证加热温度和pH值对绿原酸热降解的交互作用，实验结果见图5和表4。不同pH值下，质量浓度为3.54 mg/mL（10 mmol/mL）绿原酸单体加热10 min，均有部分绿原酸转化成为新绿原酸和隐绿原酸两种异构体。相同温度条件下，模拟模型中绿原酸异构体质量浓度随pH值升高而显著下降（P＜0.05）。在180 ℃、pH 6时，质量浓度达到痕量，3 种异构体质量浓度分别为6.25、5.34 μg/mL和 3.00 μg/mL（表4）。随pH值升高，绿原酸降解程度显著增强。经pH值和温度的交互作用分析发现，pH值对绿原酸的降解影响高度显著（P＜0.001）（表5）。Narita等[29]研究表明，绿原酸降解依赖于pH值和异构化，随pH值的升高，稳定性降低，降解加剧，本研究结果与该研究结果一致。

相同pH值条件下，反应模型中绿原酸异构体质量浓度在不同温度下差异显著（P＜0.05）（表4）。在pH值为4时，3 种异构体质量浓度在200 ℃时约为180 ℃的50%，通过因素主体效应检验发现，温度、pH值的交互作用对绿原酸的降解影响高度显著（P＜0.001） （表5）。化学反应模拟结果显示：绿原酸的快速降解可以解释为pH值和温度的交互协同增效作用，而不是某一单独因素的影响。综上，绿原酸热降解均受烘焙温度、时间和pH值的显著影响，该结果与Jiao Ye[30]和Dawidowicz[31]等的结论一致。

图 5 不同pH值条件下绿原酸单体的转化及降解图谱Fig. 5 High performance liquid chromatograms showing conversion and degradation of 3-O-CQA into 4-O-CQA and 5-O-CQA with increasing pH of roasted coffee beans

表 4 绿原酸在不同加热条件下模拟反应结果Table 4 Degradation of three caffeoylquinic acids under different temperature and pH conditions in chemical reaction models

表 5 pH值和温度的交互作用对绿原酸降解影响的分析结果Table 5 Analysis of variance for the effect of interaction between pH and temperature on caffeoylquinic acid degradation

通过绿原酸单体的模拟反应，验证了温度、时间及pH值3 种因素的交互作用导致咖啡烘焙中绿原酸的快速降解。3 种因素在咖啡烘焙中不仅促使绿原酸向新绿原酸和隐绿原酸转化，同时使其产生降解，三者之间的比例随条件不同发生动态变化，对绿原酸功效作用产生一定的影响。未来，需要进一步开展不同加工工艺、加工因素对绿原酸异构化、量效化和比例化的研究，实现绿原酸在高温加工食品体系的高值利用。

3 结 论

咖啡烘焙过程中，绿原酸类化合物均出现不同程度的降解致使含量显著降低。绿原酸快速降解受温度、时间和pH值的交互影响，各因素对不同异构体影响效果不同。新绿原酸、隐绿原酸含量随pH值升高和烘焙时间的延长而降低，呈显著负相关（P＜0.05）；绿原酸含量受烘焙时间、温度和咖啡水分质量分数影响显著，随时间延长和温度升高含量下降，呈显著负相关 （P＜0.05），与水分质量分数呈显著正相关 （P＜0.05），而pH值对绿原酸影响较弱。3 种绿原酸异构体在咖啡烘焙中的降解符合一级动力学模型。异绿原酸类异构体中异绿原酸B含量最高，异绿原酸C和异绿原酸A含量差异较小，3 种异构体均随烘焙时间的延长与温度的升高呈降低趋势。