PGS/SF小口径人工血管性能研究及体外细胞共培养

2021-06-02刘月

保健文汇 2021年9期

关键词：共培养结晶人工

文/刘月

心血管疾病是世界上最普遍的疾病之一，脑血管、心血管和外周血管系统中血管直径大多数小于6 mm[1]。

PGS有良好弹性和热稳定性，回弹性在99.5%以上，但是PGS的力学性能较低，降解速率较慢[2-3]，PGS到达一定温度后会发生固化，可以通过调节固化温度和固化时间来提高其力学性能。除此之外，还可以与其他材料复合来提高其机械性能。

本文是之前研究的延续，进一步优化了PGS/SF小口径人工血管的制备条件，并对其形貌及机械性能进行了表征，同时在PGS/SF样品膜上开展HUVECs和VSMCs体外细胞共培养实验。

1 实验

1.1 实验材料

聚癸二酸甘油酯（PGS），家蚕生丝，六氟异丙醇（C3H2F6O），聚环氧乙烷（PEO），胰蛋白酶（EDTA），HUVECs，VSMCs，DMEM高糖培养基，胎牛血清（FBS），双抗，二甲基亚砜（DMSO），二乙酸荧光素（FDA），戊二醛（C5H8O2）。

1.2 实验仪器

静电纺丝机（长沙纳仪仪器科技有限公司），CO2培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），台式电镜（日立公司），全自动酶标仪（Bio-Tek公司），激光共聚焦显微镜（A1R-si，Confocal Microscope公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 PGS热性能研究样品制备

1.3.1 .1 PGS预聚物的合成

将20.225 g癸二酸和9.209 g丙三醇加入到三颈烧瓶中，在三颈烧瓶中通入氮气并置于125℃油浴锅中加热搅拌2天后得到PGS预聚物。放入烧杯中冷却至室温，在4-8℃下密封保存备用。

1.3.1 .2 PGS固化方法

取适量的PGS放入真空干燥箱中，分别设置120、140、150、160℃对PGS预聚物进行固化，固化时间为24 h。用差示扫描量热仪（DSC）对PGS预聚物和固化后的PGS进行分析。

1.3.2 PGS/SF小口径人工血管的制备

称取0.63 g PGS预聚物和0.27 g SF膜放入带有磁力搅拌子的烧杯中，加入定量的六氟异丙醇（HFIP）配制质量分数为9%（w/w）的纺丝液。纺制膜及管状样品。静电纺丝参数为：电压为13.5 kV，接收距离为12 cm，流速为2 mL/h，转速500 rpm，固化温度为150℃。通过扫描电镜、动态表面张力仪观察PGS/SF小口径人工血管材料的微观形貌和吸湿性。通过万能材料试验机和定制的模具对固化后PGS/SF小口径人工血管材料进行径向拉伸测试。依据式（1-1）、式（1-2）计算PGS/SF小口径人工血管的断裂强度和断裂伸长率。

1.3.3 细胞培养及接种

将PGS/SF样品浸入到VEGF，在4℃冰箱中过夜。灭菌后将PGS/SF膜浸泡在培养基中并置于培养箱中过夜，细胞计数后将HUVECs稀释至5×104 cell/mL。吸取1 mL接种到24孔板中的PGS/SF膜上和爬片上；吸取200 μL接种到96孔板中的PGS/SF膜上和空白板上。

将VSMCs稀释至1×106 cell/mL。吸取100 μL接种到24孔板中的PGS/SF膜上和爬片上，3 h后，再加入900 μL培养基；吸取20 μL接种到96孔板中的PGS/SF膜上和空白样上，3 h后，再加入180 μL培养基。

1.3.4 HUVECs和VSMCs细胞共培养

先将HUVECs接种到PGS/SF膜上进行培养，1 d后将膜翻转朝下，用PGS/SF膜代替细胞小室中的Transwell膜，然后放入至12孔细胞小室和24孔细胞小室中，再在膜上接种VSMCs，3 h时后再在膜上加入培养基（细胞接种方式同（1.3.3），共培养时天数按照VSMCs的天数计算）。

1.3.5 统计学方法

采用SPSS软件对试验结果进行统计分析，用Origin作图。结果以平均值±标准差（SD）表示，采用方差分析和t检验计算数据的显著性差异。P＜0.05时记为有显著差异（*），P＜0.01时记为有极显著差异（**）。

2 实验结果与讨论

2.1 PGS DSC分析

随着PGS的固化和固化温度的升高，PGS的熔融温度和结晶温度逐渐降低，第二次升温的结晶温度低于第一次的结晶温度。这是因为随着固化温度的升高，PGS结晶逐渐转化为凝胶，该处的结晶峰主要是PGS中的凝胶部分引起的，PGS的结晶温度随着凝胶的量的增多而下降。在高温区域，即在75-105℃出现熔融峰，说明在高温区熔融峰在凝胶熔融曲线上仍部分存在[4]。

2.2 PGS/SF小口径人工血管性能研究

2.2.1 PGS/SF形貌分析

图1为不同固化温度下的PGS/SF小口径人工血管微观图像，从图中可以看出，材料中的纤维随机排列，随着温度的升高，纤维的孔隙逐渐减少。

2.2.2 接触角

120℃固化温度下的样品接触角为77.7°，具有亲水性。从130℃开始，材料表面的接触角开始大于90°，具有疏水性。由微观形貌分析可知，随着固化温度的升高，材料表面的孔隙逐渐减少。且PGS的亲水性不足，随着温度的升高，PGS熔融逐渐覆盖在SF纤维表面，导致材料表面的疏水性逐渐增强。

2.2.3 径向拉伸性能

将之前的制备工艺进行优化，即将静电纺丝后的小口径人工血管立即放入到真空干燥箱中，并提高其固化温度，其力学性能得到提升。如图3所示，随着固化温度的升高，断裂强度和断裂伸长率都有所提高，与之相反，杨氏模量随着固化温度的升高而降低。120℃和130℃固化后的PGS/SF小口径人工血管的断裂强度远远低于人内乳动脉断裂强度（3.1 MPa）[5]，而140℃-160℃固化温度后小口径人工血管的断裂强度高于人内乳动脉断裂强度。通过以上研究表明PGS/SF小口径人工血管固化温度大于130℃能得到更好地力学性能。

从径向拉伸性能的研究中可以看出，固化温度为150℃的小口径人工血管的断裂强度略低于160℃，但是其断裂伸长率是高于160℃的，所以我们最终选择固化温度为150℃作为小口径人工血管的制备条件。