余丽 宋露

（保山学院资源环境学院，云南 保山 678000）

芳香植物用作香料的历史悠久，2 000年前就有大量文献[1−2]记载了用芳香植物制作香料的历史，如用于制作香烛、防腐剂、香精、香水、化妆品、药品、食品和饮料的调味料以及抗氧化剂等[3−4]。由于芳香植物精油具有抑菌效果、抗氧化性和对生物的趋避性等天然特性，近些年以来，很多芳香植物成了较为热门的研究领域。

木姜子(Litsea pungensHemsl.)属樟科，木姜子属，落叶小乔木木姜子种，别名山胡椒、山苍子，其经济价值主要体现为中药材及木姜子精油提取应用[5−7]。木姜子性味辛、微苦，无毒，枝、叶均具有芳香味，根皮及叶可供药用，可作为中药材，有温中行气，止痛燥湿，健脾消食，解毒消肿的作用。目前对木姜子属植物的挥发油成分及生物活性的研究较多[8−10]，其主要成分有醛类和醇类，其中柠檬醛含量丰富(15.89%)，所散发的柠檬香气是重要的香料，具有平喘和抗菌功效[11−12]，同时也是合成紫罗兰酮的主要原料。但关于木姜子精油提取工艺的研究不多，本研究采用正交法优化了水蒸气蒸馏法提取木姜子果实中精油的条件，并研究了该木姜子精油的抑菌效果，为木姜子资源开发及木姜子精油的利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

木姜子：购买产自四川自贡的木姜子干果；

大肠杆菌（Eccherichia coli），金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aurens)，铜绿假单胞菌(Pseudomo⁃nas alcaligebes)，黑曲霉(Aspergillus niger)，酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，由保山学院微生物实验室提供。

1.2 实验仪器

电子天平、无菌操作台、粉碎机、微量移液管等。

1.3 试剂和培养基

试剂：氯化钠，吐温80。

培养基：马铃薯培养基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培养基（NA）。

1.4 方法

1.4.1 水蒸气蒸馏法提取精油

将木姜子果实用破壁机打碎进行避光储存，称取25 g木姜子，按照一定料液比加入一定量的氯化钠，浸泡一定的时间后利用水蒸气蒸馏法[13−14]进行精油提取，将提取出的木姜子精油置于棕色瓶中放入4℃冰箱中储藏。根据公式计算精油提取率[14−17]。

V：木姜子精油提取体积

M：木姜子质量

1.4.2 单因素实验

准确称取木姜子25.0 g，选择浸泡时间（0 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h）、料液比（1︰15、1︰20、1︰25、1︰30、1︰35）、提取时间（1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h）、NaCl浓度(0 g/L、15 g/L、30 g/L、45 g/L、60 g/L)4个因素，在某一单因素为变量的条件下（固定因素分别取料液比1：25，浸泡3 h，NaCl浓度30 g/L，提取时间2.5 h）进行精油提取，计算精油得率。考察各因素对木姜子精油得率的影响，用于确定提取精油条件的最佳范围。

1.4.3 正交实验

在单因素试验的基础上，选取浸泡时间（A）、提取时间（B）、料液比（C）、氯化钠（D）四个因素通过L9（34）进行正交试验设计，正交试验各因素水平及试验方案见表1、表2。

表1 正交试验因素与水平设计

表2 正交设计试验方案

1.4.4 木姜子精油的抑菌活性

采用倍比稀释法探讨木姜子精油对不同菌种的最小抑菌浓度（MIC）。具体操作为：首先将木姜子精油分别配制成浓度为0.125%、0.250%、0.500%、1.000%、2.000%的溶液，取各浓度溶液1 mL分别与15 mLPDA培养基、NA培养基混合制成含不同浓度木姜子精油的平板培养基。其次取已调至合适浓度（细菌、酵母菌浓度为108cfu/mL,霉菌孢子浓度调成105cfu/mL）的5种待测菌悬液各200 μL均匀涂布于相应培养基中（细菌为NA，酵母菌、霉菌为PDA），每个浓度做3组重复。最后细菌在37℃下培养24 h，酵母菌、霉菌在28℃下培养48 h～72 h，观察菌落生长情况，将平板中完全不出现菌落生长的最低浓度作为提取液的MIC值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 浸泡时间对木姜子精油提取的影响

由图1可知，在取料液比1：25，NaCl浓度30 g/L，提取时间2.5 h条件下，随着浸泡时间的延长，精油提取的量逐渐增加；当浸泡时间达到3.0 h时，木姜子精油的提取量最大，之后随着浸泡时间的延长，木姜子精油提取的量逐渐下降。这是因为在浸泡3.0 h后已经达到饱和，随着时间延长也不能再吸收水分，同时水分过多也会增加精油收集的难度。由图1可知，精油提取的合适浸泡时间在2.0 h～4.0 h之间。

图1 浸泡时间对木姜子精油提取的影响

2.1.2 料液比对木姜子精油提取量的影响。

由图2可知，在浸泡3 h，NaCl浓度30 g/L，提取时间2.5 h条件下，随着料液比的增加，木姜子精油的提取量逐渐增加；当料液比为1︰25时，木姜子精油提取量达到最高；之后随着料液比的增加木姜子精油的提取量逐渐下降。这可能是因为当料液比小时水分分散不彻底影响出油率，料液比大时溶于水中的精油较多影响精油收集使精油得率降低。综合多方面考虑，确定合适的料液比范围为1︰20～1︰30之间。

图2 料液比对木姜子精油提取量的影响

2.1.3 提取时间对木姜子精油的影响。

由图3可知，在料液比1：25，浸泡3 h，NaCl浓度30 g/L条件下，随着提取时间的增加，木姜子精油的提取量增加；当提取时间为3.0 h，木姜子精油的提取量达到最高；之后随着提取时间的增加木姜子精油的提取量逐渐下降。这是因为提取3.0 h后，精油已基本被蒸馏出来，再延长时间也不会增加精油得率，同时精油是一种易挥发物质，提取时间过长也会使精油挥发导致精油损失。综合提取效率、提取成本等多方面因素，确定精油合适的提取时间范围为2.0 h～3.0 h之间。

图3 提取时间对木姜子精油的影响

2.1.4 NaCl浓度对木姜子提取量的影响。

在精油提取中加入氯化钠是为了加速油水混合物分层，同时盐析作用也可降低精油在水中的溶解度，便于精油收集增加提取率。随着浓度增加盐析效果反而减弱，精油得率下降。由图4可知，在料液比1：25，浸泡3 h，提取时间2.5 h条件下，随着氯化钠浓度的增加，木姜子精油的提取量逐渐增加；当氯化钠浓度达到30 g/L时，木姜子精油的提取量达到最大；之后随着氯化钠浓度的增加，木姜子精油的提取量逐渐下降。综合考虑，确定氯化钠浓度合适范围为15 g/L～45 g/L之间。

图4 NaCl浓度对木姜子提取量的影响

2.2 正交试验结果分析

根据单因素试验确定木姜子精油提取各因素的合适范围，进行四因素三水平正交试验，结果见表3、表4。

表3 木姜子精油提取水平设计

表4 正交实验结果

根据正交试验结果，各因素对木姜子精油提取的影响顺序为D＞C＞A＞B,即氯化钠浓度的变化对木姜子影响最大，其次是料液比，再然后是浸泡时间，最后是提取时间。最佳参数组合为A1B2C2D2或A1B2C3D2,考虑成本因素，本实验采用A1B2C2D2组合，即木姜子浸泡2.0 h，提取2.5 h，料液比为1：25，氯化钠浓度为30 g/L，在此条件下精油得率为2.01 mL/100g。

2.3 木姜子精油的抑菌活性

由表5可知，抑菌效果随木姜子精油浓度减小而降低，其中对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.25%，对铜绿假单胞菌的MIC值为2.000%，对酵母菌、黑曲霉、大肠杆菌的MIC值为0.500%。这说明木姜子精油对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用。

表5 MIC值的测定

3 结论和讨论

通过正交实验结果得出水蒸气蒸馏法提取木姜子精油的最佳方案是木姜子浸泡2.0 h，提取2.5 h，料液比为1：25，氯化钠浓度为30g/L。此方案提取出的精油品质较好，精油得率2.01 mL/100 g。同时水蒸气蒸馏法所得精油具有无有机溶剂残留、安全无毒、可直接使用等特点[13,15]，有利于对其进行深入研究。

木姜子精油对5种受试菌均有不同程度的抑制作用，最小抑菌浓度的测定得到各菌种的MIC值：金黄色葡萄球菌的MIC值为0.25%，铜绿假单胞菌的MIC值为2.000%，酵母菌、黑曲霉、大肠杆菌的MIC值为0.500%，其中金黄色葡萄球菌对木姜子精油敏感性较强，这个结果与项昭保[8]研究结果比较相似。这说明木姜子精油具有很好的抑菌作用和重要的药用价值。

木姜子挥发油成分研究表明[7−12]，挥发油组成主要包括萜烯类、醛类、醇类和酮类，同时木姜子不同的部位其挥发油成分有很大差别[11]。本研究采用水蒸气蒸馏法提取木姜子果实精油，可以为更有效的提取研究和利用木姜子精油提供一定的理论依据。木姜子精油较好的抑菌性能，也能够为天然防腐剂的开发应用提供一定的理论基础。