卫雪红， 臧晓南， 石佳伟， 丛晓梅， 昝佳伟

(中国海洋大学海洋生物遗传与育种教育部重点实验室， 山东 青岛 266003)

亚硫酸还原酶 (Sulfite reductase, SiR) 催化亚硫酸盐转化成硫化物，是亚硫酸同化代谢路径中的关键酶。有研究表明，SiR活性对拟南芥正常生长是必不可少的，其下调会引起严重的一级和二级代谢适应性反应[16]。亚硫酸还原酶在高等植物中研究广泛，目前已在玉米、高粱、水稻等植物中克隆得到亚硫酸还原酶基因，并对酶进行了分析[17]。但在藻类中对亚硫酸还原酶的研究较少。

本文首次克隆和分析了雨生红球藻的sir基因，并用qRT-PCR方法检测了sir基因在不同亚硫酸盐浓度下的变化，验证了其与硫代谢的相关性，最后检测了不同硫酸盐浓度对雨生红球藻生长和sir基因转录水平的影响。本研究为了解雨生红球藻硫代谢机理奠定了基础，也为雨生红球藻培养基的优化提供了理论指导。

1 材料与方法

1.1 藻种和培养条件

本实验选用的雨生红球藻藻株(HaematococcuspluvialisHOUC9)来源于中国海洋大学藻类遗传学实验室。雨生红球藻绿色生长阶段选用的培养基为改良型BG-11培养基(g/L)：0.255 NaNO3，0.045 6 K2HPO4·3H2O，0.68 NaAc·3H2O，0.026 64 CaCl2，0.125 7 MgSO4·7H2O， 0.075 95 Ferric citrate，0.01 EDTA·Na2，0.000 5 VB12，1 mL A5+Co solution(g/L: 28.6 H3BO4，18.1 MnCl2·4H2O，2.22 ZnSO4·7H2O，3.9 Na2MoO4·2H2O，0.79 CuSO4·5H2O，0.494 Co(NO3)2·6H2O)。培养在250 mL三角瓶中，每瓶培养液体积为100 mL。光源为日光灯，光照40 μmol·m-2·s-1，光暗周期为12 h/12 h，温度为(23±1)℃。取对数生长期的藻以1∶10的比例接种，每天摇瓶3次。

1.2 引物设计及合成

所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表1。

表1 雨生红球藻sir基因扩增及定量PCR分析所用引物

1.3 雨生红球藻DNA的提取

采用DNA提取试剂盒E.Z.N.A.TMHigh Performance (HP) Plant DNA Kit(Omega)，按照有关说明，提取雨生红球藻DNA。使用Nanodrop 2000c(Thermo Scientific，USA)测定DNA浓度及OD260/OD280，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，检测合格后待用。

1.4 总RNA的提取和cDNA的合成

实验采用RNA提取试剂盒R6827 Plant RNA Kit(Omega)提取雨生红球藻总RNA，具体操作参考R6827 Plant RNA Kit试剂盒的说明书。使用Nanodrop 2000c 测定浓度及OD260/OD280，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。 采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser对提取的RNA进行反转录，合成cDNA第一链。

1.5 sir DNA克隆

根据实验室前期雨生红球藻转录组测序结果[18]，设计引物sir-1/sir-2(见表1)。以提取的雨生红球藻DNA为模板，进行PCR扩增。用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，使用胶回收试剂盒(Omega)将清晰的目的条带进行切胶回收，将胶回收产物与pEASY®-T3 Cloning Vector载体(TaKaRa)进行连接，连接后转化到感受态细胞E.coliDH5α中，然后在含有100 μg/mL氨苄青霉素的固体LB琼脂培养基上进行筛选。将震荡培养后的菌液作为模板，M13F/M13R作为通用引物进行菌落PCR检测；电泳检测后将筛选得到阳性克隆菌株进行测序鉴定，阳性克隆由北京基因组研究所(BGI)进行测序。

1.6 sir cDNA克隆与测序

根据DNA序列全长，使用软件DNAMAN[19]设计引物sir-3/sir-4(见表1)，以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，得到雨生红球藻亚硫酸还原酶cDNA序列。使用CLUSTALX[20]比较DNA和cDNA序列后，预测外显子和内含子序列。

1.7 sir 基因序列分析

应用DNAMAN软件进行氨基酸序列的预测和翻译。ExPASy ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质的等电点和分子量。使用InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) 软件分析预测雨生红球藻sir编码的蛋白质家族、结构域和保守序列。使用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)和GenBank核酸数据库进行同源性分析[21]。对蛋白质的二级结构和三级结构的分析采用软件NPS@: GOR4[22]和SWISS-MODEL[23]。应用MEGA5.1[24]构建系统进化树。

1.8 不同Na2SO3浓度下雨生红球藻sir转录水平分析

为验证sir基因的功能，本文研究了亚硫酸盐浓度对sir基因表达的影响。设置4个亚硫酸盐Na2SO3浓度梯度，分别为0、1、10、50 mmol/L。每组设置3个平行样，培养10 d，每2天取样进行sir基因转录水平的测定。

根据克隆得到的雨生红球藻亚硫酸还原酶cDNA完整序列设计目的基因引物：qsir-1/qsir-2 , 并以核酮糖1,5 -二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亚基基因作为内参基因，设计引物rbcL-1/rbcL-2 ，进行实时荧光定量PCR，根据RQ=2-△△Ct分析数据并作图[25]。

1.9 培养基中不同硫浓度下雨生红球藻生长和sir转录水平的分析

为优化雨生红球藻中的硫浓度，本文探究了sir对培养基中不同硫浓度的响应，利用实时荧光定量PCR方法，分析了其在不同硫浓度下的转录情况。BG-11培养基中硫酸盐MgSO4·7H2O的浓度为0.127 5 g/L，以此为基础设计5个MgSO4·7H2O浓度梯度，分别为0、0.05、0.1、0.2和0.5 g/L。每组设置3个平行样，培养10 d，每两天取样进行生物量的测定和sir基因转录水平的测定。

2 结果与分析

2.1 雨生红球藻sir序列分析

以雨生红球藻的基因组DNA为模板，引物为sir-1/sir-2进行PCR扩增，获得3 885 bp的扩增条带。以雨生红球藻RNA反转录获得的cDNA为模板，引物为sir-3/sir-4进行PCR扩增，获得2 079 bp的扩增条带。

对来自H.pluvialis的sir基因预测分析表明，其由3 885个核苷酸组成，如图1所示，通过将基因组DNA与cDNA序列进行blast比对确定其包含9个内含子。内含子位置分别位于391～458、756～886、1 085～1 207、1 322～1 559、1 664～1 848、1 979～2 150、2 342～2 580、2 804～3 066和3 130～3 513 bp。sir序列中的内含子遵循GT-AG边界规则。

(加粗斜体表示内含子。方框内为起始密码子ATG和终止密码子TGA。 The italics represent introns. The potential start codon ATG and stop codon TGA were marked with a character border.)

雨生红球藻sir的cDNA ORF为2 079 bp，编码692个氨基酸，MW为75.757 kDa，根据ProtParam工具预测的pI为9.12。

使用InterPro软件分析预测雨生红球藻sir编码的蛋白质家族、结构域和保守序列，如图2所示，雨生红球藻SiR蛋白属于NiR/SiR铁氧还蛋白超家族，包含两个结构域：Nitrite/Sulfite reductase ferrdoxin-like结构域和Nitrite/Sulfite reductase 4Fe-4S结构域。Nitrite/Sulfite reductase ferrdoxin-like结构域位于103～159位氨基酸残基和398～462位氨基酸残基的位置，Nitrite/Sulfite reductase 4Fe-4S结构域位于199～378位氨基酸残基和475～610位氨基酸残基的位置。根据保守结构域分析，推测获得的雨生红球藻sircDNA表达的蛋白质可能具有亚硫酸还原酶的功能。

通过NPS@: GOR4预测分析得到SiR的蛋白质二级结构，包括α螺旋(42.42%)，延伸链(16.16%)和无规则卷曲(41.41%)区域。结果如图3所示，N端有一段长的α螺旋，中间主要为延伸链和无规则卷曲。

图2 雨生红球藻SiR InterPro预测结果

图3 雨生红球藻SiR二级结构预测结果

使用SWISS-MODEL分析软件对雨生红球藻SiR三级结构进行预测分析，如图4所示，α螺旋、延伸链和无规则卷曲进一步折叠形成雨生红球藻SiR三级结构。在5’端分布着一段长的α螺旋，这与图3的二级结构预测结果相一致，无规则卷曲暴露在三级结构的外面，与酶的活性位点区域相对应。

图4 雨生红球藻SiR蛋白的三级结构预测结果

2.2 多序列比对分析

通过DNAMAN分析软件将推导的雨生红球藻SiR的氨基酸序列与来自其他物种的SiR进行多重序列比对，序列比对突出显示75%的相似性，如图5所示，结果表明SiR氨基酸序列的保守性较高。保守氨基酸序列包括QLMKFHGSYMQDDREKRSFG、LKTVFSTVIKNMGSTLAACGDVNRNVM、ADLLAPQSGAYYDVWLDGEKFVS、FLPRKFKVAVTVPGDNSVDLFTNDLG、VRMTGCPNGCARPYMAEMGFVGDGPNSYQ等。其中保守氨基酸序列ADLLAPQSGAYYDVWLDGEKFVS、FLPRKFKVAVTVPGDNSVDLFTNDLG和VRMTGCPNGCARPYMAEMGFVGDGPNSYQ位于Nitrite/Sulfite reductase 4Fe-4S结构域内。亚硫酸盐还原酶在不同物种中序列相似性较高，而且在关键酶域的相似性更高，进一步表明获得的雨生红球藻SiR极有可能具有亚硫酸还原酶的功能。

(雨生红球藻(Haematococcus pluvialis h1)、团藻 (Volvox carteri f. nagariensis，GenPept No.：XP_002948803.1)、小球藻 (Chlorella variabilis，GenPept No.：XP_005846743.1)、盘藻 (Gonium pectorale，GenPept No.：KXZ50217.1)、胶球藻C-169 (Coccomyxa subellipsoidea C-169，GenPept No.：XP_005649394.1)、衣藻 (Chlamydomonas eustigma，GenPept No.：GAX82049.1))

2.3 分子进化分析

使用分析软件MEGA5.1对雨生红球藻SiR的氨基酸序列与其他物种的亚硫酸还原酶基因编码的氨基酸序列进行分子进化树分析。如图6所示，雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)与莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、团藻(Volvoxcarterif.nagariensis)、小球藻(Chlorellavariabilis)等聚为一支，拟南芥(Arabidopsisthaliana)作为陆地模式生物，与烟草(Nicotianatabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)等聚为一支。雨生红球藻与莱茵衣藻、团藻的亲缘关系较近，与陆生植物和菌属的亲缘关系较远。序列的相似性与物种间的亲缘关系保持一致。

(莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，拟南芥 (Arabidopsis thaliana)，烟草 (Pisum sativum)，团藻 (Volvox carteri f. nagariensis)，衣藻 (Chlamydomonas eustigma)，盘藻(Gonium pectorale)，小球藻 (Chlorella variabilis)，胶球藻属(Coccomyxa subellipsoidea C-169)，氮化克氏菌属 (Klebsormidium nitens)，黄连链球菌 (Ostreococcus lucimarinus CCE9901)，陶氏链球菌(Ostreococcus tauri)，番茄 (Solanum lycopersicum)。该进化树自展值为1 000，分支前的数字表示该分支正确性的可靠程度，进化树下的标尺表示氨基酸替代率，0.1代表每100个氨基酸有10个不同雨生红球藻HOUC9和其他物种的亚硫酸还原酶氨基酸序列。Bootstrap=1 000. The number before the branch indicates the reliability of the correctness of the branch. The scale under the phylogenetic tree indicates the nucleotide/amino acid substitution rate, and 0.1 indicates that there are 10 differences per 100 amino acids. Molecular evolutionary tree based on sequences of sulfite reductase from H. pluvialis HOUC9 and other species.)

2.4 不同亚硫酸盐浓度对sir基因转录水平的影响

为验证雨生红球藻中克隆得到的sir基因与硫代谢的相关性，本文研究了不同亚硫酸盐Na2SO3浓度(0～50 mmol/L)对sir基因转录水平的影响。如图7所示，前4天，各组基本呈下调表达。在第6天，添加10、50 mmol/L Na2SO3组显著上调。在第8～10天，各组基本都上调，且sir基因转录水平随Na2SO3添加量呈正相关，说明从雨生红球藻中克隆的sir基因与亚硫酸盐代谢途径是直接相关的，确定其是雨生红球藻的亚硫酸还原酶，并在硫代谢途径中起着重要的作用。

图7 不同Na2SO3浓度下雨生红球藻SiR的转录水平

2.5 培养基中不同硫浓度对雨生红球藻sir基因转录水平和生长的影响

为了优化雨生红球藻培养基中的硫浓度，作者研究了BG-11培养基中不同硫酸盐浓度下的sir基因的转录情况。BG-11培养基中初始MgSO4·7H2O的浓度为0.127 5 g/L，以此为基础设计5个MgSO4·7H2O浓度梯度，分别为0、0.05、0.1、0.2和0.5 g/L。不同硫浓度下雨生红球藻亚硫酸还原酶的转录水平如图8所示，从第2天开始，除0.5 g/L组上调外，其余各组都开始出现下调，在第4天出现回调，0.5 g/L组在第4天达到最高水平，显著高于其他各组。在第6天五组全部下调，0.05 g/L组和0.2 g/L组下调最显著，除0.1 g/L组外其余组下降到最低水平。在第8～10天，各组整体出现上调趋势。总体看来，sir基因的转录水平会随培养时间呈周期性变化。

图8 不同硫浓度下雨生红球藻SiR的转录水平

在硫对雨生红球藻的细胞生长影响的实验中(见图9)，第2天，0.5 g/L组就表现出明显的优势，细胞密度显著高于其他各组；低于0.5 g/L各组没有明显差异，也均能够促进雨生红球藻细胞的生长。随后几天，0.5 g/L组藻细胞密度继续显著增加，从第8～10天开始增长趋于缓慢，但生物量仍远高于其他五组。这表明适宜的硫浓度对于雨生红球藻细胞密度起到重要作用，低于0.5 g/L时，各组间的差异并不显著。当MgSO4·7H2O浓度达到0.5 g/L，雨生红球藻细胞密度显著增加。

图9 雨生红球藻在不同硫浓度下细胞密度

3 讨论

硫与碳、氮一样，在植物新陈代谢和发育中起着关键作用。Cys作为硫酸盐同化途径产生的第一个还原硫产物，是蛋氨酸(Met)及其衍生物、谷胱甘肽、维生素(如生物素，硫胺素)、辅因子(如铁-硫簇，血红素，钼中心，硫辛酸)和硫化合物的硫供体，它们在植物细胞的生长发育中起着重要作用[26]。在植物中，无机硫酸盐还原成硫化物是合成各种含硫化合物(如氨基酸，硫脂和辅酶)的重要代谢过程。ATP硫酸化酶通过ATP激活硫酸盐后形成腺苷5'-磷酸硫酸盐(APS)，APS进一步被APS还原酶还原成亚硫酸盐，亚硫酸还原酶进一步催化亚硫酸盐到硫化物的六电子还原[27]。

本文从雨生红球藻中首次克隆得到sir基因的全长，其由3 885个核苷酸组成，包含9个内含子，cDNA序列全长2 079 bp，编码692个氨基酸，MW为75.757 kDa。对雨生红球藻亚硫酸还原酶氨基酸序列进行分析发现，SiR蛋白质属于NiR/SiR铁氧还蛋白超家族。多序列比对显示SiR的氨基酸与团藻(Volvoxcarterif.nagariensis)的SiR氨基酸具有78%的相似性，与莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的相似性为72%，这说明亚硫酸还原酶的序列同源性较高。使用MEGA5.1软件对雨生红球藻SiR与其他物种SiR进行分子进化树分析，结果同样显示雨生红球藻与莱茵衣藻、团藻的亲缘关系较近。表明亚硫酸还原酶氨基酸序列的分子进化关系与物种进化关系相一致。

据报道，硫在绿藻细胞生长中发挥着重要的作用，小球藻(Chlorella)中的一些含硫化合物在细胞分裂过程中具有调控作用，而且在细胞核分裂之前会显著增加[28]。在眼虫属(Euglena)和四尾栅藻(Scenedesmusquadricauda)细胞周期中起着关键作用的硫醇和含硫代谢物在缺硫条件下减少，这导致细胞分裂间期的RNA、蛋白质等生物大分子的合成以及DNA的复制难以进行，以致细胞核与细胞无法进行分裂，子细胞的产生减少[29-30]。维持谷胱甘肽稳态对植物适应干旱胁迫至关重要。干旱胁迫下，SO2可通过提高谷子叶片中的亚硫酸还原酶等酶的活性，诱导相关基因表达上调，从而使叶组织中的半胱氨酸和还原型谷胱甘肽含量增加[31]。有研究表明，SO2逆境胁迫下，玉米叶子的转录水平随时间的延长显著升高，根部也随时间的延长而有所升高。在相同SO2逆境胁迫条件下，相对于根部而言玉米新叶的亚硫酸还原酶相对表达量最高，花丝(传输花粉和向正在发育的胚中运输营养物质)次之。亚硫酸还原酶催化亚硫酸盐还原成硫酸盐，不仅能够抵抗SO2对植株的伤害，还能促进营养物质的合成，对植物的生长和发育具有一定影响[17]。在本研究中，作者分析了不同硫浓度下雨生红球藻的生物量及亚硫酸还原酶的转录水平。在0.5 g/L MgSO4·7H2O浓度下，细胞生长明显得到促进，表明适宜的硫浓度对雨生红球藻的生长有显著影响。亚硫酸还原酶的转录水平结果说明在不同硫浓度下其转录水平存在差异，且随培养时间呈周期性变化。不同亚硫酸盐浓度对sir基因转录水平的影响实验结果表明，sir基因与亚硫酸盐代谢途径是直接相关的，表明SiR是雨生红球藻亚硫酸盐代谢途径中的关键酶。

综合以上分析说明硫浓度影响雨生红球藻亚硫酸还原酶的转录水平，结合雨生红球藻的生长情况，作者建议选择0.5 g/L MgSO4·7H2O作为适宜雨生红球藻绿色生长阶段的硫浓度，为进一步提高虾青素的产量提供实验数据和指导依据。