★严张仁 潘俊卿 胡香君 张思娜 申淑娴 王万春

（1江西中医药大学附属医院中医外科 南昌 330006；2.江西中医药大学研究生院 南昌 330004）

前列腺炎（prostatitis）是前列腺在病原体或（和）某些非感染因素作用下，出现以骨盆区域疼痛或不适、排尿异常等症状为特征的一组疾病，好发于成年男性各年龄段，全球发病率高达10 %～15 %［1］。美国国立卫生研究院（NIH）根据临床表现将其分为：Ⅰ型:急性细菌性前列腺炎（ABP）；Ⅱ型:慢性细菌型前列腺炎（CBP）；Ⅲ型:慢性前列腺炎/慢性骨盆综合征（CP/CPPS）；Ⅳ型:无症状型前列腺炎（AIP）［2］。病原体感染是Ⅰ、Ⅱ型前列腺炎主要致病因素；Ⅲ型前列腺炎病因发病机制尚不明确但可能与病原体感染、排尿功能异常、神经内分泌失调、免疫反应异常及氧化应激等因素相关［3］。前列腺炎根据分型可选择采用抗生素、α受体阻滞剂、非甾体抗炎镇痛药等对症治疗和支持治疗，但治疗周期较长，临床疗效欠佳，特别是Ⅱ、Ⅲ型前列腺炎，病情迁延难愈，反复发作，常伴有性功能障碍，焦虑，抑郁等症状，严重影响患者身心健康和生活质量。

前列腺炎属中医“精浊”“淋证”和“白浊”等范畴，中医药治疗前列腺炎经历代医家不断的临床实践，对本病诊治提供了丰富的经验，积累了众多疗效明确的中药、方剂，如前列腺汤、解毒活血汤等。茯苓，味甘，淡，性平，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿，健脾，宁心的功效；泽泻，味甘，淡，性寒，归肾、膀胱经，具有利水渗湿，泄热，化浊降脂的功效。《伤寒论》中五苓散、猪苓汤、肾气丸、茯苓泽泻汤等方剂常使用茯苓、泽泻相须配伍主治小便不利，淋证等前列腺疾病［4］。闵杰等［5］和孟明洋等［6］对中医药治疗前列腺炎文献挖掘发现“茯苓-泽泻”药对使用频次较高。目前中医药防治前列腺炎研究多集中在炎症代谢通路实验研究领域，而针对前列腺炎复杂的发病机制，缺乏利用基因组学、蛋白组学和网络药理学等新技术、新手段综合探讨中医药治疗前列腺的相关机制研究［7］。本研究基于文献挖掘的基础上采用网络药理学探索“茯苓-泽泻”药对活性成分及药效作用机制对前列腺炎的整体治疗，分析“茯苓-泽泻”多成分、多靶点、多通路的协同调控前列腺炎相关病理生理功能作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物活性成分及潜在靶点检索与筛选 在ETCM（http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/index.php/）数据库数据库中分别检索“茯苓”“泽泻”中包含的化合物及化合物对应的潜在靶点，并选取Druglikeness Weight≥0.3的化合物作为药物活性成分。ETCM中化合物的类药性评价采用的是Bickerton团队于2012年发表于Nature Chemistry的算法。靶标预测采用的是MedChemStudio（3.0版）软件。MedChemStudio是药物相似性搜索软件，用于查找与中药成分具有高度结构相似性（Tanimoto＞0.8）的已知药物，从而进行靶标预测［8］。

1.2 疾病相关靶点检索 以“prostatitis”为关键 词,分 别 在GeneCard（https://www.genecards.org/)、CTD(http://www.ctdbase.org/）数 据 库 选 取Score≥30的靶点作为前列腺炎潜在作用靶点，去除重复后并使用Uniprot数据库（http://uniprot.org）中UniprotKB功能,物种设置为human,对筛选的靶点蛋白及基因进行校正得到疾病靶点Genesymbol。

1.3 药物-活性成分-靶点-疾病网络构建与分析 采用在线绘图Omishare Tools平台（http://www.omicshare.com/tools/）获得“茯苓-泽泻”药对与前列腺炎共同靶点及Venn图。共同靶点信息借助Cytoscape3.7.1软件构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络模型并使用Network Analyzer插件对网络进行分析。

1.4 共同靶点功能分析 为明确共同靶点之间的相互作用，将共同靶点导入String(http://string-db.org/)数据库中进行蛋白相互作用（protein-protein interaction network,PPI network）网络分析,并将PPI网络分析结果导入Cytoscape3.7.1软件中构建PPI网络并使用Network Analyzer插件对网络进行网络拓扑学分析，在DAVID6.8（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）中对共同靶点进行GO（Gene Ontology） 及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通 路 富 集 分 析，选 取P＜0.05且FDR＜0.05作为显著功能与通路的临界值，在Omishare Tools平台绘制排名前20的KEGG通路气泡图，并将排名前20的GO分析中生物学过程按PValue值大小列出。

2 结果

2.1 药物活性成分及潜在靶点、疾病相关靶点 从ETCM数据库中筛选出茯苓活性成分31个，预测靶点231个；泽泻活性成分22个，预测靶点251个。检索出疾病相关靶点633个。茯苓-泽泻药对与前列腺炎同有靶点22个，茯苓对前列腺炎特有调控靶点13个；泽泻对前列腺炎特有调控靶点28个。详见图1和表1。

图1 “茯苓-泽泻”药对与前列腺炎靶点交集Venn图

表1 “茯苓-泽泻”药对与前列腺炎靶点交集

2.2 药物-活性成分-靶点-疾病网络构建与分析 运用Cytoscape软件构建药物-活性成分-靶点-疾病网络，如图2，共得到119个节点，590条边，53个中药活性成分，共同参与调节63个前列腺炎相关靶点。网络节点平均连接度为9.916，中位数为7，定义网络中连接度大于或等于10 的节点为网络核心节点，核心节点在网络中关联性强，具有更大的影响，在网络中更重要。核心成分节点33个，茯苓24个，泽泻8个；核心靶点节点15个。连接度最高活性成分的前5个为13Î’,17Î’-epoxyalisol A、dehydroeburicoic acid、eburicoic acid、3Î’-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid、trametenolic acid、dehydroabietic acid methyl ester，说明这些成分可以同时调控较多的靶点，可能在药物治疗疾病中发挥较高的作用；核心靶点节点前10为NR3C1，AR，HSD3B1，PGR，VDR，ESR1，NCOA1，RXRA，HDAC2，COX5B，说明这些靶点可能受到药物作用较强，在药物治疗疾病中更突出。

从图2总体可以看出，茯苓-泽泻通过多种活性成分，共同调节多个多疾病相关靶点发挥药效作用。

图2 茯苓-泽泻药物成分-靶点-疾病网络图（箭头表示靶点，红色为药对共同靶点，绿色箭头为泽泻特有调控靶点，紫色箭头为茯苓特有调控靶点；矩形表示活性成分；节点大小与连接度成正比）

2.3 共同靶点功能分析 对63个共同靶点进行PPI网络构建，有62个共同靶点之间相互关联存在互作关系，共583条边，平均连接度为18.806，表明共同靶点之间通过583个相互作用关系紧密相互作用调控62个疾病靶。PPI网络分析提示AKT1、STAT3、ESR1、CASP3、CCND1、AR、SRC、TNF、MDM2、PTGS2等靶点相互作用更强，可能是发挥治疗作用的重要靶点，而TNF、PTGS2是炎症通路中重要的靶点之一，见图3。

对63个共同靶点进行GO功能分析及KEGG富集分析,得到生物过程（biological proces，BP）12个、细胞组分（cellular component，CC）1个，分子功能（molecular function，MF）6个，KEGG信号通路39条，排名前30条通路，见图4。共同靶点功能分析结果显示共同靶点主要GO分析涉及RNA聚合酶II启动子转录的正调控、类固醇激素受体活性、RNA聚合酶II转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA结合、RNA聚合酶II启动子的转录起始，RNA聚合酶II的转录与翻译是疾病基因表达的重要生物学过程。KEGG功能分析涉及前列腺癌、PI3K-Akt信号通路、细胞周期、P53信号通路、生成信号通路、EB病毒感染等，其中肿瘤坏死因子信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、细胞凋亡等信号通路在炎症中发挥重要作用。由此看出，茯苓-泽泻可以通过调节多个生物途径，多个生物信号通路发挥治疗前列腺炎的作用机制。

图3 共同靶点蛋白-蛋白相互作用网络（黄色圆圈表示连接度Degree≥20的节点，节点大小与连接度成正比）

图4 共同靶点GO分析和KEGG富集分析前30气泡图

3 讨论

细菌性前列腺炎是在机体抵抗力降低时病原体，尤其是革兰阴性菌中大肠埃希菌感染腺体，引起前列腺组织出现充血、水肿，腺泡或间质内出现大量中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞的浸润，甚至形成小脓肿，进而出现泌尿系感染等症状［9］。非细菌性前列腺炎尤其是Ⅲ型前列腺病因病机尚不明确，目前认为：（1）排尿功能异常：尿液反流使尿液中尿酸、肌酐等刺激前列腺诱发疼痛，且尿酸沉积导致前列腺组织炎症［10］；（2）免疫功能失调：免疫抑制细胞功能降低，促炎及抗炎介质失衡，尤其是Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞比例失衡［11-12］；（3）氧化应激：氧自由基持续作用导致前列腺发生缺氧，导致水肿及纤维化或支配前列腺的神经受损［13］；（4）神经内分泌紊乱：疼痛物质P、神经生长因子（nerver growth factor，NGF）等细胞因子诱导胶质细胞介导L5-S2节段脊髓神经功能障碍［13］；（5）其他，骨盆相关疾病、精神心理因素均与前列腺炎发生相关。目前针对前列腺炎的治疗十分局限且疗效一般，发现具有靶向性的活性成分是精准治疗前列腺炎的新方向。

本研究筛选的茯苓主要成分为茯苓酸，三萜类成分。研究表明茯苓三萜化合物具有利尿作用［14］，因而减轻前列腺炎排尿异常反应，茯苓三萜成分对急、慢性炎症均有抑制作用［15］。茯苓辛酸C对巨噬细胞产生NO的抑制作用并通过下调核因子NF-κB来抑制iNOS和COX-2表达从而发挥抗炎作用［16］。茯苓酸通过减弱白细胞与微血管内皮细胞间的黏附,抑制肠黏膜微血管内皮细胞的过量分泌,阻止过多白细胞到达炎症部位和过度炎症反应,发挥抗炎作用［17］；茯苓酸是一种新的拓扑异构酶抑制剂，能有效抑制DNA聚合酶的活性，使细胞停留在G1期，抑制细胞水肿及纤维化［18］。三萜类成分也是泽泻发挥药理活性的主要成分，具有抗炎、抗菌、利尿等作用［19］。本研究筛选出三萜类13个，倍半萜5个，泽泻主要通过三萜类和倍半萜发挥成分发挥治疗作用。泽泻三萜能抑制toll样受体4（TLR4）/NADPH氧化酶2（NOX2）信号通路发挥抗炎作用［20］；Alisol B 23-acetate作用PI3K-AKT信号通路［21］。泽泻总三萜可以减少炎症介质的释放，抑制急性炎症对炎症造成的组织增生有抑制作用［22］。因此，茯苓-泽泻药对主要通过茯苓三萜类成分，泽泻三萜类和泽泻倍半萜成分发挥治疗前列腺炎的作用。

中药治疗疾病具有多成分-多靶点-多通路的特点，靶点之间相互作用，组成复杂的网络调控体系。共同靶点PPI分析，生物功能分析和通路富集结果显示AKT1、STAT3、ESR1、TNF、MDM2、PTGS2、PGR、NFKB1、HIF1A、MAPK14、PIK3CA、IL1B等是关键靶点；蛋白激酶活性、一氧化氮生物合成过程的正调控、RNA聚合酶II启动子转录起始，正负调控，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等是关键的生物学过程；前列腺癌、PI3KAkt信号通路、细胞周期、p53信号通路、TNF信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、FOxO信号通路、HIF-1信号通路、VEGF信号通路是关键的信号通络。MAPK14在由促炎细胞因子或者物理刺激等细胞外刺激所引发的细胞级联反应中起重要作用；TNF、IL1B是一些炎症病理生理反应最重要的调节因子；PTGS2在机体炎症反应过程中起着十分重要的作用，主要功能之一就是催化花生四烯酸产生前列腺素E2，广泛参与机体多个组织和器官的炎症反应。TNF、Toll样受体信号通路信号通路与炎症免疫调控，氧化损伤相关［23］；HIF-1 信号通路在炎症因子调控及低氧浓度或缺氧应答中发挥重要作用的；PI3K-AKT信号通路在某些病毒复制过程中必须激活。本研究结果表明，茯苓-泽泻可能作用于TNF、MDM2、PTGS2、PGR、NFKB1、MAPK14等的多个靶点，作用于PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、FOxO信号通路、HIF-1信号通路TNF、等多个信号通路，调控RNA聚合酶II启动子转录起始，正负调控，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性治疗前列腺炎。

综上所述，“茯苓-泽泻”药对相须配伍，主要通多其三萜类成分调节TNF、PTGS、NFKB1、MAPK14等靶点，促进RNA聚合酶II启动子转录起始，正负调控，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性，调控PI3K-Akt、TNF、HIF-1、Toll样受体信号通路等参与组织的抗炎、氧化应激等生物学修复过程。茯苓-泽泻多成分，共同参与调节到前列腺的多个相关靶点中，协同参与相关信号通路综合改善前列腺的病理生理过程。值得注意的是目前中药主要成分提取及其类药性研究仍然不足，重要成分靶点多建立在计算机模拟预测和既有药物研究基础上的比对，预测靶点在疾病中发挥的机制仍需基础研究来验证。因此，本研究仍需进一步的中药药理实验研究加以验证。