熊文涛,沈雨民,陈明亮,罗世友,熊焕金,吴小燕,肖叶青

(江西省农业科学院 水稻研究所/水稻国家工程实验室(南昌)/国家水稻改良中心 南昌分中心,江西 南昌 330200)

东乡野生稻(以下简称“东野”)是迄今为止发现的分布纬度最北的普通野生稻,其蕴藏了其他普通野生稻和栽培稻所不具备的强耐冷性[1-2]。近年来,研究人员陆续从东野后代群体中筛选到多个综合农艺性状优良的耐冷株系[3-4]。其中,从东野和粳稻0298的杂交后代筛选的耐冷粳稻东野1号的稻蔸能成功越冬,该品种已通过江西省农作物新品种审定[5]。目前,相关研究报道了东野的3个耐冷基因,以及低温响应调控因子ICE1的同源基因OrbHLH1[6]；通过QTL定位区段找到了候选基因LTT7[7]和Cold1[8],其中Cold1起源于中国普通野生稻,经过人工驯化及筛选,现普遍存在于东北亚的粳稻品种中[8]。

赣香A是本课题组选用1504(赣早籼49号)、IR58025B、金23B、新露B和江农早2号B等5个具不同优良特性的保持系做亲本,采用杂交、复交和系统选择等方法选育出来的新品种[9]。该品种的综合农艺性状优良,如落色好、不早衰、千粒重较大、有香味等,而且对稻瘟病具有很强的抗性。

为了能够将东野中的耐冷基因导入赣香B中,从而提高赣香B的耐冷性，我们在前期的研究中以赣香B为受体亲本,以东野为供体亲本,进行回交,利用分子标记进行辅助选择,从回交后代中选择性状优良的单株进行耐冷性鉴定,创制了携带耐冷基因的赣香B品种[10]。之后对赣香B和耐冷性较好的株系IL742在常温和低温下的表型进行测序及表达谱差异分析,找到了东野中与冷胁迫相关的6个基因[11]。为了进一步探究这些冷胁迫相关基因的分子机理,本研究构建了这些基因的过量表达载体,并利用农杆菌介导法获得了转基因阳性植株,可为进一步研究这些基因的分子机理提供可靠的材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转化受体材料为赣香B的成熟种子;转化菌株为农杆菌EHA105;双元转化载体pCUbi3190由江西省农业科学院超级稻中心提供。

1.2 超表达载体的构建

以从越光材料中提取的cDNA为模板,用引物Os05g15770FKpnI(5′-GGGGTACCATGGCGTCCCGACGCCTTG-3′)和Os05g15770RSpeI(5′-GACTAGTTCACAGAACCTGATCCAGGAGACC-3′)以及KODFX酶(Takara)进行PCR扩增，获得了OsHI-XIPCDS序列。用KpnI和SpeI酶切PCR纯化产物及pCUbi1390表达载体,然后通过DNA连接酶进行连接,转入大肠杆菌DH5a体内,通过筛选克隆、酶切检测以及测序分析获得了正确的OsHI-XIP超表达载体。最后电激转化农杆菌EHA105,于-80 ℃下保存备用。

1.3 愈伤组织的诱导及继代

将赣香B的成熟种子去壳后用70%乙醇浸泡1 min,随后用50%次氯酸钠处理30 min,在转速180 r/min的摇床上摇晃。用无菌水冲洗8～10次,最后将冲洗好的种子放到灭菌滤纸上晾干5 min。在每个倒有诱导培养基的培养皿中放入12～13粒种子,放入(27±1)℃、黑暗环境下培养。经过14 d的黑暗诱导,挑选胚性愈伤组织,将其平均分成3等份，分别放入新的诱导培养基中在(27±1)℃、黑暗环境下继代培养4 d。

1.4 农杆菌介导的转化体系建立

从固体划线平板上挑取农杆菌EHA105单克隆菌株,放入装有5 mL YEB液体培养基的50 mL离心管中。将该离心管放置于200 r/min的摇床上，在28 ℃下暗培养20～24 h；之后将离心管中的培养液转入加有100 mL YEB的500 mL三角瓶中,在相同培养条件下培养。当OD600到达1.0时,将农杆菌细胞在4 ℃条件下以8000 r/min离心15 min，进行富集；最后用悬浮培养基将农杆菌细胞重悬。将重悬后的农杆菌细胞浸入水稻愈伤组织,在转速50 r/min的摇床上缓和培养20～25 min,用灭菌滤纸吸干愈伤组织上的多余菌液。之后将这些愈伤组织转入共培养基,在(27±1)℃、黑暗条件下共培养48 h。一旦在愈伤组织中出现了少量农杆菌,即用加入了适当浓度的头孢噻肟无菌水清洗8～10次,再用灭菌滤纸吸干，然后将其转移到筛选培养基中,在(27±1)℃、黑暗条件下培养12 d。经过第一轮筛选培养后,挑选正常的愈伤组织，将其转移到新的筛选培养基上进行第二轮培养。经过10 d的第二轮筛选培养,挑选新长出来的微小愈伤组织，再将其转移到新的筛选培养基上进行第三轮筛选,在(27±1)℃、黑暗下培养5 d。将第三轮筛选培养基中长出的颗粒状的微小愈伤组织转移到分化培养基上,在(27±1)℃、黑暗条件下培养7 d;之后将愈伤转移至新的分化培养基上,在(27±1)℃、光照条件下培养4 d。最后转移分化出来的幼苗到生根培养基上,待幼苗长出较发达的茁壮根系时进行移栽炼苗。

1.5 转基因植株的检测

剪取植株的幼嫩叶片,参考王关林等的CTAB法提取DNA,采用PCR方法扩增检测植株内的潮霉素(HPT)基因。所用引物hpt557-F为5′-ACACTACATGGCGTGATTTCAT-3′,hpt557-R为5′-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3′。反应体系(10 μL): DNA模板30～50 ng、1.1×T3 Super PCR Mix 9.1 μL、10 μmol/L引物各0.2 μL。反应条件:98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,54 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,32个循环；72 ℃ 2 min,25 ℃ 1 min。

2 结果与分析

2.1 超量表达载体OsHI-XIP+pCUbi1390的获得

通过PCR扩增、酶切等过程将该基因连接到pCUbi1390载体上(图1),然后转入大肠杆菌,提取其质粒进行酶切或者PCR检测及测序分析。共提取了15个质粒进行PCR检测,结果只有3个质粒能扩增出目的条带(894 bp)(图2)。进一步对这3个质粒进行测序比对发现,OsHI-XIP+pCUbi1390-8质粒序列正确(图3)。

2.2 农杆菌介导的水稻遗传转化

籼稻的遗传转化效率普遍较低,严重影响了籼稻品种转基因工作的开展。为了提高籼稻的转化效率,我们对农杆菌介导的赣香B转化体系进行了系统研究。统计结果表明:赣香B的侵染愈伤数为500,其中抗性愈伤数为82,转化效率为16.4%;检测转基因苗数为23,其中阳性转基因苗数为16,阳性苗率为69.6%；这两个参数显著高于其它大部分籼稻品种,可见,赣香B作为转化受体,其转化效果显著优于其他籼稻品种,是一个很好的籼稻转基因受体材料。

2.3 转基因植株的PCR检测及阳性苗的获得

以获得的23株ZH11转化苗(编号为19OSH513_1～23)叶片的总DNA为模板,以hpt557-F/R为引物,进行PCR扩增反应。然后分别取PCR产物5 μL,采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果(图4)显示,有16株ZH11转化苗扩增出潮霉素基因(HPT,557 bp),因此初步鉴定获得了16株PCR阳性植株。最后,种植T0代的转化苗，获得了种子；目前已经种植到T1代苗期(图5)。

图2 部分OsHI-XIP+pCUbi1390质粒的PCR检测结果

图3 OsHI-XIP+pCUbi1390-8质粒中基因片段的测序结果

3 讨论与结论

赣香B是本课题组选育的优质籼型香稻保持系,其母本为赣香A,具有开花习性好、异交结实率高、抗稻瘟病、米质优良且有香味等特点。目前,利用赣香A已成功配制杂交稻品种或组合15个,并且通过了福建、海南、云南、四川、重庆、贵州、浙江和江西等多个省(市)品种审定,如赣优明占、赣优607、赣香优702、赣优810等。由于赣香B的综合农艺性状优良,是研究水稻重要农艺性状相关基因的重要材料,亟须建立该材料的遗传转化体系。目前,大部分籼稻品种的组织培养都面临不同程度的困难,比如有些品种的愈伤组织不耐继代,有些品种的抗性愈伤容易褐化死亡,有的品种的抗性愈伤不能分化成幼苗等,进而导致籼稻品种的转化效率极低。本试验首次成功建立了赣香B的遗传转化体系,而且转化效率稳定维持在16%以上,显著高于一般籼稻品种的转化效率。因此,赣香B可以作为优良的籼稻转化受体品种,从而建立起水稻高效率的遗传转化体系。

B代表空白对照；N代表阴性对照；P代表阳性对照。图4 转化再生植株PCR检测结果

图5 T1代的田间转化苗

东野是迄今为止分布纬度最高的普通野生稻,除了蕴藏着丰富的种质资源、具有强抗逆性外,还拥有其他普通野生稻和栽培稻所没有的强耐冷性,具有很大的育种价值。为了让赣香B能够获得较强的耐冷性,本研究前期已构建以赣香B为受体亲本,以东野为供体亲本的渗入系群体,并通过冷胁迫处理筛选出了赣香B的耐冷株系。基于耐冷株系和赣香B的转录组比较分析,筛选出6个响应冷胁迫的基因,我们重点研究了其中的OsHI-XIP基因。该基因亚细胞定位于内质网上,编码1个糖基水解酶；过量表达OsHI-XIP基因能够增强水稻对植食性昆虫的抗性[12]。目前尚未见该基因耐冷方面的报道。为了进一步研究OsHI-XIP的生物学功能,我们构建了OsHI-XIP的超表达载体,利用农杆菌介导法将OsHI-XIP基因转入赣香B的愈伤组织中,通过筛选、分化培养获得了转基因苗(图5)。这为后期进一步研究耐冷基因的生物学功能,为研究东野的耐冷机制提供了可能。本研究首次建立了以赣香B为受体的农杆菌介导的籼稻高效遗传转化体系,为后期研究优良农艺性状相关基因的分离、克隆及生物学功能验证奠定了坚实的材料基础，提供了强有力的技术支撑,也为水稻分子育种奠定了基础。