郑文燕 李哲 蔡燕娟 许润娟

中山市食品药品检验所，广东 中山528400

当归养血丸为益气养血调经类中药复方制剂，收载于《中国药典》（2015年版）一部［1］，处方由当归、白芍、地黄、炙黄芪、阿胶、牡丹皮、香附、茯苓、杜仲、白术组成，阿胶在处方中投料量约为7%。近年来，随着胶类药材用量增长，巨大的利益驱动和尖锐的供需矛盾导致胶类药材的生产环境乱象丛生，市场上含胶类的制剂存在不投、少投、掺伪投料的现象［2-3］。针对胶类药材造假问题，中国食品药品检定研究院开展了一系列的研究工作，建立了阿胶、龟甲胶、鹿角胶3种胶类药材专属性特征肽的鉴别方法［1］以及其补充检验方法［4-6］，以期提高胶类药材的质量控制水平。《中国药典》（2015年版）收载的含胶类药材的成方制剂共44个，仅有两个制剂品种（阿胶三宝膏、复方阿胶浆）的现行标准中，收载了专属性强的胶类药材特征肽的检测方法［7］，大多数缺乏针对制剂中胶类药材的专属性质量控制项目，使得含胶类药材的中成药掺伪造假投料的现象存在很大空间。

目前，当归养血丸中专属性强的阿胶药材鉴别方法尚无文献报道，现行标准也无针对动物药材阿胶的质控方法，这使得该制剂的售价差异很大，质量难以保证，也给患者的用药安全带来隐患。近年来，关于胶类制剂中阿胶药材的专属性检测方法研究报道较多［8-11］，本文采用UPLC-MS/MS技术，建立当归养血丸中阿胶专属性特征肽的鉴别方法，以期保障该制剂的安全有效。

1 仪器与材料

Agilent 1290～6460 Triple Quad超高效液相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；AB SCIEX 3200 Q-Trap超快速高效液相色谱-质谱联用仪（美国AB公司）；XS205DU电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超纯水器（德国Merck Millipore公司）；SB-300 DTY超声波多频清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；BWS-0510型水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

黄明胶（批号121695-201301）、阿胶（批号121274-201703）、对照药材购自中国食品药品检定研究院；胰蛋白酶（质谱级，Promega公司）；甲酸、乙腈（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；当归养血丸阴性样品为按照质量标准处方自制的不含阿胶的样品，实验所用样品为本单位在流通环节抽样或通过网络渠道购得。

表1 样品信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（2.1×100mm，1.8μm）柱；流速0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相：乙腈（A）和0.1%甲酸溶液（B）进行梯度洗脱；洗脱程序：0～25min 5%～20%A，25～40min 20%～50%A。

2.2 质谱条件离子化方式：ESI+离子源，扫描模式MRM，雾化器压力为45psi，干燥气流量为5L/min，干燥气温度为325℃，毛细管电压为3500V，鞘气温度为350℃；检测离子对：阿胶特征分子离子峰m/z539.8（双电荷）→923.8，612.4作为检测离子对［1］。

2.3 供试品溶液的制备取当归养血丸适量，研碎，精密称取处理好的样品1.50g，置50mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液适量，超声处理30min使溶散，再加上述溶液稀释至刻度，摇匀，离心（转速为3500r/min）5min，取上清液，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液100μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白溶液（1μg/μL）10μL，摇匀，37℃恒温酶解12h，即得。

胰蛋白溶液（临用时配制）：取胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1μL中含1μg的溶液。

2.4 对照药材溶液的制备取对照药材粉末（约0.10g）适量，精密称定，置50mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液适量，超声处理30min使溶解，再加上述溶液稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液100μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白溶液（1μg/μL）10μL，摇匀，37℃恒温酶解12h，即得。

2.5 专属性试验用不含阿胶的样品和黄明胶作为阴性样品，选择阿胶特征分子离子峰m/z 539.8（双电荷）→612.4，923.8作为检测离子对进行测定，结果阴性样品色谱图中，与对照药材（阿胶）溶液相应的位置上，无相应的色谱峰，认为当归养血丸阴性样品以及其他胶类如黄明胶对当归养血丸样品测定无干扰，方法专属性良好。见图1。

2.6 检测下限测定取阿胶对照药材粉末（约0.10g）适量，精密称定，置50mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液适量，超声处理30min使溶解，再加上述溶液稀释至刻度，摇匀。取该溶液适量，并平行称取4份当归养血丸阴性样品（1.50g），照“2.3供试品溶液的制备”方法分别制得含阿胶为0.2%、0.5%、1%、5%的当归养血丸系列溶液，以阿胶特征分子离子峰m/z 539.8（双电荷）→612.4，923.8作为检测离子对进行测定，结果含阿胶为0.2%的当归养血丸溶液中，阿胶特征分子离子峰的信噪比约为3∶1，因此检测下限为含阿胶为0.2%的当归养血丸样品溶液，在MRM模式下检测。

图1 当归养血丸（A）、阿胶对照药材（B）、阴性样品（C）、黄明胶对照药材（D）的EIC色谱图a m/z 539.8（双电荷）→612.4 b m/z 539.8（双电荷）→923.8

2.7 重复性试验取当归养血丸样品（批号：180302），按“2.3供试品溶液的制备”项平行制备6份供试品溶液，测定。结果当归养血丸供试品溶液中均检出相应的阿胶特征肽离子峰，以m/z539.8（双电荷）→923.8，612.4特征分子离子峰峰面积计算，峰面积的RSD分别为4.3%、2.4%，表明方法具有良好的重复性。

2.8 样品测定以所建立的方法对3个厂家10批次当归养血丸样品进行测定，结果均检出阿胶特征肽，可以作为制剂中阿胶药材的鉴别方法。

表2 当归养血丸中阿胶检测结果

3 讨论

3.1 供试品制备方法的考察当归养血丸为处方中各味药材粉末投料生产，制剂中炼蜜含量较高，供试品超声处理后，溶液混浊较黏稠，若直接采用0.22μm微孔滤膜滤过，操作困难。因此供试品超声处理后采用离心的方式，除去溶液中的沉淀，得到较澄清的上清液后，再滤过，取续滤液进行酶解。为考察阿胶粉末在溶散过程中是否能够溶解完全，制备过程中阿胶分别为以粉末及溶液两种状态与当归养血丸阴性样品混合，比较阿胶特征分子离子峰的峰面积。结果显示，阿胶固体样品和阿胶液体样品中阿胶特征分子离子峰的色谱峰面积基本一致，表明前处理过程中，阿胶粉末溶解完全。

3.2 酶解时间和酶量的考察参考《中国药典》（2015年版）阿胶鉴别方法［1］，阿胶的取样量为0.1g，依据当归养血丸处方量及制剂工艺计算，每1.50g丸中约含有0.10g阿胶对照药材，由此确定供试品的取样量为1.50g。

参考《中国药典》（2015年版）阿胶鉴别方法的酶解时间和酶用量［1］以及《中国药典》（2015年版）四部“通则3405肽图检查法”中的溶剂条件［12］，在37℃恒温水浴中，取1.50g当归养血丸，酶用量分别为10、15、20μL（酶浓度1mg/mL），酶解8、12、16、20h后分别进样，计算当归养血丸中阿胶特征分子离子峰的峰面积。结果表明当归养血丸取样量为1.50g，酶用量10μL，酶解时间12h与酶用量20μL，酶解时间20h中阿胶特征分子离子峰的峰面积基本一致。最终确定当归养血丸取样量为1.50g，酶用量为10μL，酶解时间为12h。

3.3 耐用性考察考察了本方法在Agilent 1290-6460 Triple Quad、AB SCIEX 3200 Q-Trap，两台高效液相色谱-质谱联用仪上的重现性，以m/z 539.8（双电荷）→612.4，923.8作为阿胶特征肽离子对进行检测，结果表明两个品牌的UPLC-MS/MS均可检出阿胶特征分子离子峰，方法耐用性良好。

3.4 结论当归养血丸现行质量标准中缺乏专属性强的阿胶鉴别方法，阻碍了该类制剂的质量控制和市场监管。本文所建立的当归养血丸中阿胶的定性鉴别方法专属性强、准确可靠、重现性好，可以对制剂中阿胶药材进行有效监控，为该类制剂的疗效及服用安全提供保障，具有重要的社会应用价值。