周媛 王斌 罗军

听神经病缺乏有效的治疗，其发病机制及病理仍需进一步研究。有研究表明，内耳自身免疫可能是引起听神经病的重要原因[1～3]。P0蛋白是周围神经髓鞘细胞膜上的一种结构蛋白，其含量约占细胞膜蛋白含量的50%以上；该蛋白在内耳中分布于耳蜗螺旋神经节、听神经的有髓神经纤维髓鞘中[4]。Cao等[5]发现P0蛋白为自身免疫性内耳病的相关抗原，并且具有内耳组织特异性；林熹等[6]用纯化的P0蛋白成功诱发了豚鼠内耳自身免疫反应。本研究拟用P0蛋白免疫大鼠，增加P0蛋白免疫量，并延长免疫周期，旨在建立免疫成功率更高的自身免疫性听神经病动物模型，为听神经病的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1P0蛋白的提取和纯化 健康SD大鼠20只，雌雄不限，体重250～300克，由郑州大学实验动物中心提供。用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔内注射麻醉，动物麻醉后断头，迅速取出听泡，在无菌及4 ℃条件下取出全膜迷路组织，参照林熹[6]的方法，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)提取和纯化P0蛋白：将全膜迷路组织置于含1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、10 mmol/L二巯基乙醇(β-ME)和40 mg/ml苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)(均购于sigma，美国)的PBS中，反复冻融4次，4 ℃下以12 000转离心30分钟，取上清蛋白液，即为粗提膜迷路蛋白液；采用BCA(bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)法测定蛋白浓度，BCA试剂盒购自赛默飞公司。分别灌制浓度为5%的浓缩胶和浓度为12.5%的分离胶，将粗提膜迷路蛋白液与等体积的样品缓冲液(4%SDS、2%二巯基乙醇和l%溴酚蓝)沸水浴3分钟，加样4 ℃下恒温电泳，当溴酚蓝泳至胶的底部时结束电泳。将凝胶浸泡于冰冷的0.5 mol/L KCl溶液约10分钟，切下相当于30 kD的条带，电洗脱约4小时，回收蛋白液，用聚乙二醇适当浓缩。BCA法测定蛋白浓度，将蛋白液依次用0.1 mol/L MgCl2、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)透析去除结合在P0蛋白上的SDS，浓缩后低温贮存，备用。

1.2动物分组及P0蛋白免疫大鼠建立动物模型 健康SD大鼠60只，雌雄不限，体重250～300克。随机数字表法随机分成对照组10只、实验组50只。实验组用上述纯化的大鼠P0蛋白作为抗原进行免疫，为了提高免疫成功率，本研究增加了P0蛋白免疫量，用含400 μg/ml P0蛋白的凝胶匀浆液1 ml与等量完全弗氏佐剂(Gibco，美国)乳化后，给予大鼠双后肢内侧及背部多点皮下注射，并延长免疫周期，共免疫8周，每间隔一周，用首次抗原用量的一半与等量不完全弗氏佐剂作加强注射。对照组在同一时间和部位以不含抗原的等量弗氏佐剂注射。

1.3听功能测试 分别于免疫后2、4、6、8周检测各组大鼠听性脑干反应(ABR)、畸变产物耳声发射(DPOAE)的变化。

ABR检测：采用美国TDT系统(Tucker-Davis Technologies hardware and software, TDT System III, Alachua, FL, USA)，动物麻醉后，隔声屏蔽室内，将参考电极置于测试耳耳后，记录电极置于颅顶正中，接地电极置于测试耳对侧耳后。刺激声为短声(click)，带通滤波宽度设置为300～3 000 Hz，叠加次数为1 024次，最大刺激强度为100 dB SPL，每隔10 dB递减，以能分辨出可重复的ABR波V的最低刺激强度判断阈值；先测试左耳，再测试右耳。ABR测试结束后，立即行DPOAE检测，采用Madsen Capella Plus耳声发射仪进行DPOAE测试，探头密封于外耳道内，原始纯音频率比f2/f1为1.2，L2/L1=60/65 dB SPL；f2分别为0.5、1、2、4、8 kHz，叠加120次，以DPOAE幅值大于本底噪声3 dB为引出标准；先测试左耳，再测试右耳。

1.4血清IgG水平测定 免疫前，采用酶联免疫吸附测定(试剂盒购于R&D Systems，美国)检测血清抗P0蛋白抗体的IgG水平；于最后1次ABR测试结束后(即免疫8周后)心脏取血，收集血清，同法再次检测血清抗P0蛋白抗体的IgG水平；以测得的吸光度表示IgG水平。

1.5内耳形态学观察 动物于最后一次听功能测试结束后处死，迅速取出听泡，4%多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙，常规石蜡包埋,连续中轴切片，光镜(Leica，DMIL-PL，德国)观察内耳组织学变化并行螺旋神经元计数[7]。电镜(日立S4800，日本)观察：听泡蜗尖钻孔灌注3%戊二醛，1%四氧化锇后固定，梯度乙醇脱水，醋酸异戊酯过度，临界点干燥、镀膜，扫描电镜观察毛细胞。

1.6统计学方法 采用SPSS10.0软件进行t检验和方差分析，实验数据以均数±标准差(mean±standard deviation)表示。

2 结果

提取的P0蛋白经SDS-PAGE后显示，只在相对分子质量为30 kD的位置上出现单一的蛋白染色带，证明本实验纯化的确为P0蛋白(P0蛋白分子量约为30 kD)。提取纯化P0蛋白的效率为：4.12 mg纯化P0蛋白/45.51 mg粗提膜迷路蛋白。

实验组50只大鼠，在实验中死亡5只；对照组10只，2只死亡。存活大鼠行耳镜检查，无中耳炎。

2.1免疫8周后大鼠血清IgG水平 实验组免疫前血清中抗P0蛋白的IgG水平与对照组无明显差异，免疫8周后，实验组大鼠血清IgG水平升高，明显高于免疫前和对照组(P<0.05)(表1)。

表1 两组大鼠免疫前后血清IgG水平

2.2DPOAE检测结果 免疫前后实验组及对照组均可正常引出DPOAE(图1)，免疫8周后，实验组DPOAE振幅无明显变化(P>0.05)(表2)。

图1 实验组大鼠P0蛋白免疫前(a)、后(b)DPOAE图

表2 实验组各频率免疫前后DPOAE幅值

2.3ABR检测结果 实验组存活的45只大鼠，于免疫8周后，16只(32耳)波V反应阈提高≥40 dB(36%，16/45)，18只(36耳)波V反应阈提高<20 dB(40%,18/45),11只(22耳)ABR波V反应阈提高<10 dB(24%,11/45)。ABR波V反应阈提高≥40 dB的16只(32耳)大鼠及对照组各时间点的ABR波V反应阈见表3，可见与对照组相比较，随着免疫时间的延长，实验组大鼠ABR反应阈逐渐升高，免疫8周后，阈值升高最为明显(P<0.01)。

表3 两组大鼠免疫前及免疫后各时间点ABR反应阈

2.4耳蜗的形态学变化 免疫8周后两组大鼠螺旋神经元计数结果见表4，可见实验组罗氏管内螺旋神经元缺失严重(图2),螺旋神经元数量明显减少(P<0.05)。

图2 实验组P0免疫前后螺旋神经元缺失情况 a.免疫前正常罗氏管，示螺旋神经元；b.P0免疫后8周，仅见少量残余螺旋神经元细胞，神经节区域呈现“荒漠样”改变(bar=100 μm)

表4 两组大鼠免疫8周后耳蜗各回螺旋神经元计数

2.5实验组免疫前后毛细胞的电镜观察 免疫8周后与免疫前比较，实验组毛细胞形态无明显变化，无明显缺失(图3)。

3 讨论

听神经病(auditory neuropathy，AN)的病因及发病机制一直是研究的难点, 学者们的研究表明内耳自身免疫与AN发病有关[8～11]。国内外学者先后建立了不同的自身免疫性AN动物模型，Matsuoka[8]用P0蛋白诱导鼠产生自身免疫性神经炎，为周围神经脱髓鞘病变，动物出现听神经病的听力学改变，但对蜗神经脱髓鞘改变未能予以电镜证实；宋鹏等[9]以粗提的牛外周神经髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)作为抗原免疫豚鼠后，其ABR反应阈升高，伴波I、Ⅲ、V潜伏期明显延长，坐骨神经、听神经均发生脱髓鞘改变；刘宏建等[10]提取、纯化耳蜗神经抗原免疫豚鼠，免疫后豚鼠听性脑干反应阈提高10～25 dB；林熹等[6]用纯化的P0蛋白免疫豚鼠，建立了豚鼠自身免疫性AN动物模型，免疫后有22%的豚鼠ABR反应阈升高。李海英等[11]用从豚鼠内耳组织中纯化的P0蛋白免疫SD大鼠，以ABR阈值较免疫前升高15 dB为阳性，电镜下可见听神经的脱髓鞘病变。本研究在上述研究者的方法上加以改进，加大了P0蛋白的免疫量，并将免疫周期延长至8周，结果45只(90耳)大鼠中有16只(32耳)(36%，16/45)ABR的波V反应阈升高≥40 dB，ABR严重异常，DPOAE正常，免疫成功率(36%)较高。

Matsuoka等[8]用从牛周围神经纯化的P0蛋白免疫小鼠，成功地使其中约20%的小鼠听力减退，组织学检查发现蜗轴区域炎性细胞浸润，螺旋神经节细胞数目减少，提示P0蛋白在自身免疫性感音神经性聋中起到作用。本研究中用P0蛋白免疫大鼠后，光镜下见实验组大鼠罗氏管中螺旋神经元明显缺失，螺旋神经元计数亦证实螺旋神经元数量明显减少，与Matsuoka等[8]的报道相同；本研究中大鼠毛细胞的形态与数量无明显变化，ABR阈值升高，而DPOAE未见异常，说明P0蛋白免疫大鼠后导致了蜗后性聋。

Passali等[12]发现部分耳聋患者的血液中存在抗P0蛋白IgG抗体，本研究在免疫前后检测了大鼠血清中IgG水平，免疫8周后大鼠血清IgG水平较免疫前明显升高，说明机体对P0蛋白产生了免疫反应；随着免疫时间的延长，其ABR阈值逐渐提高，螺旋神经元的数量明显减少，但DPOAE正常，毛细胞无明显变化。这些结果均提示P0蛋白诱发了内耳自身免疫反应，且免疫反应的程度随着免疫时间的延长而逐渐加重；由此可见，P0蛋白免疫量的增加及免疫时间的延长对造模成功起到了重要作用。

本研究成功建立了自身免疫性听神经病动物模型，对自身免疫性听神经病的后续研究，如：机制探索、药物治疗等提供了实验基础。