厉磊 秦燕 刘维红 王冠东 邵春雷 王雷之

（山东省临沂市畜牧发展促进中心 276000）

临沂市是畜牧业大市，其中蛋鸡养殖是部分农民发家致富的重要手段。禽流感是由A 型禽流感病毒引起的一种高度接触性、急性传染病。H5、H7亚型高致病性禽流感给养禽业造成的经济损失巨大，被我国列为一类动物疫病。2004 年，我国开始对H5亚型高致病性禽流感实施强制免疫政策，2017 年又对H7亚型实行强制免疫。如何评价疫苗免疫效果尤为重要。每年本市根据省兽医主管部门（省畜牧兽医局）动物疫病监测计划下达本行政区域的动物疫病监测计划。鸡高致病性禽流感免疫效果的监测，需要按一定比例采样，抽取鸡血析出血清后，做血凝和血凝抑制试验来判定结果。采取鸡血需要专业技术人员操作，并且需要采取必要的防护隔离措施，消耗大量的人力、物力。并且捉鸡、采血使鸡产生较大的应激反应，对蛋鸡产蛋有一定的影响。母鸡以特定抗原免疫后，能产生相对应的特应性抗体，抗体除存在于血清中外，还可以储存于卵黄中，称为卵黄抗体。因此，卵黄抗体与血清抗体应存在一定的相关性，若能收集蛋样检测卵黄抗体，则可以减少鸡群采血应激[1]，而且操作更为方便。鉴于此，本中心于2019 年10～12 月，选择了部分蛋鸡场进行高致病性禽流感免疫注射和抗体水平检测，并对血清抗体效价和卵黄抗体效价进行了比较分析，为生产实践中产蛋鸡卵黄抗体检测H5、H7亚型禽流感免疫抗体提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

在兰山区、河东区选择6 个蛋鸡养殖场，日龄均在180～190 日龄。

1.1.2 疫苗

重组禽流感（H5、H7）三价灭活疫苗（H5N1Re-11 株+Re-12 株、H7H9），哈药集团生物疫苗生物疫苗有限公司生产。

1.1.3 检测试剂

H5亚型（Re-11 株、Re-12 株）禽流感病毒血凝抑制试验抗原及阳性血清，H7H9亚型禽流感病毒血凝抑制试验抗原及阳性血清，均为哈尔滨维科生物科技开发公司产品，均在有效期内。

1.1.4 试剂

pH7.2 0.01mol/L PBS、1%鸡红细胞悬液均按照 《GB/T 18936-2003 高致病性禽流感诊断技术》 要求配置。

1.1.5 试验器材

96 孔v 型微量反应板、单道、8 道移液器(品牌BRAND)、加样吸头、离心机、振荡器等。

1.2 试验方法

1.2.1 疫苗注射

选6 个养殖场分别注射重组禽流感（H5+H7）三价灭活疫苗。

1.2.2 样品采集

注射疫苗后14、21、28、40、50、60d 分别对应采集同一只鸡血清和鸡蛋。每个养殖场采集鸡30 份。

1.2.3 样品处理

血清样品：无菌翅静脉采血，室温放置待血液凝固自然析出血清，必要时用低速（1500～2000r/min）离心5～10min，分离血清。

卵黄样品：鸡蛋清洁消毒，磕开沥出蛋清，只留蛋黄在半边蛋壳中。在样品管中加入0.5mlPBS 液，再吸取0.5ml 卵黄做1:1 稀释，振荡器上混匀制成卵黄检样备用。

1.2.4 HI 抗体效价测定

取待检血清样品和卵黄样品，按照GB/T 18936-2003 血凝（HA）试验和血凝抑制(HI) 试验进行H5、H7亚型禽流感免疫抗体检测。

2 检测结果

抗体HI 效价平均值统计结果见表1、表2、表3。

3 分析与讨论

由表1、表2、表3 可知，疫苗免疫14～60d，H5、H7亚型禽流感抗体，卵黄抗体与血清中的抗体水平同升同降，免疫后40d 均达到最高值，说明二者的HI 抗体效价具有较强的相关性。

疫苗免疫14～28d，H5、H7亚型禽流感免疫抗体水平逐渐上升，但卵黄样品的HI 效价比血清样品的HI 效价低1～2 个滴度，这主要是因为抗体是由血液传递到卵黄的，卵黄的形成需要一定时间，所以卵黄抗体较血清抗体的检测结果相比有一定滞后性[2]。

免疫28～60d，卵黄与血清样品的禽流感抗体HI 效价（平均）基本一致，差异不显著（＞0.05）。

4 小结

本试验结果表明，蛋鸡免疫重组禽流感三价疫苗28d 后，卵黄与血清抗体水平差异不显著，具有较强的相关性，可以用卵黄代替血清进行禽流感免疫抗体检测，应选择在免疫28d 后。

用鸡蛋检测高致病性禽流感免疫抗体，采样不需要专业技术，没有外人进入、不用捉鸡、采血，对鸡不会造成任何应激，不会影响家禽的健康和生产性能，很好地缓解了养殖场户对采样的抵触情绪，有利于免疫监测的顺利进行。

表1 H5亚型Re-11 禽流感抗体HI 效价（平均）检测结果统计(log2)

表2 H5亚型Re-12 禽流感抗体HI 效价（平均）检测结果统计(log2)

表3 H7亚型禽流感抗体HI 效价（平均）检测结果统计(log2)