杨佩儒，文 彬，赵烛芳

(1.中国科学院西双版纳热带植物园热带植物资源与可持续利用重点实验室，云南 勐腊 666303；2.中国科学院大学，北京 100049；3.云南农业大学，云南 昆明 650201)

柚子是重要的经济作物。中国很早就有关于柚的记载，晋代学者郭璞在《尔雅》的注释中就有“柚属也，子大于盂，皮厚二、三寸，中似枳 ,食之少味”[1]，说明柚类在中国具有悠久的种植历史。同时，中国还是柚的起源中心和分布中心，且种植面积大、产量高、品种多[2]。然而，近年来由于优良品种的推广，一些传统品种处于流失的边缘[2]。为了柚子的可持续发展，保护柚类品种的遗传多样性，研究柚类种子的保存刻不容缓。

种子根据其贮藏特性一般分为3类，即正常性种子、顽拗性种子和中间型种子[3—4]，正常性种子能耐低温和脱水，适合在低温干燥条件下保存；顽拗性种子不耐脱水且对低温敏感，常规条件很难保存；而中间型种子不能忍受像正常性种子那样的脱水，但在脱水到相对低的含水量时还能存活[5]。

柚类种子根据贮藏行为可以归类到中间型种子[2,6]，目前超低温保存是唯一有希望实现顽拗性/中间型种子长期贮藏的方法[7]。依据工作原理可将超低温保存分为两类：一类是依据冷冻脱水的原理，结合程序降温技术，利用程序降温仪或连续降温冰冻装置等仪器设备控制降温速度，存活关键在于降温冷冻环节；另一类则是根据玻璃化原理，采用快速降温的方法[8]，主要技术包括包埋-干燥法、玻璃化法和滴冻法等[9—10]。

超低温保存能否成功是由材料特性、预培养方法、冷冻保护剂、冷冻方法等因素共同决定的[10]。关于柑橘属植物种子和柑橘属植物种质资源的超低温保存，已经有了比较多的研究。Pérez等[11]在1997年成功地超低温保存了四个品种的橙(Citrus sinensis)，三个品种的葡萄柚(C. paradisi)，以及来檬(C. arantifolia)、柠檬(Citrus limon)、酸橙(C.aurantium)的胚性愈伤组织。在 1998年，Gonzalez-Arnao等[12]使用包埋脱水法实现对来檬茎尖的超低温保存。2002年，Al-Ababneh等[13]同时采用包埋玻璃化法、玻璃化法和包埋脱水法三种方式超低温保存酸橙的茎尖，三种方式都取得成功，而包埋脱水法效果最佳。Gonzalez-Arnao等[14]使用包埋脱水法超低温保存了橙、柠檬、葡萄柚、柑橘(C.reticulata)和酸橙的体细胞胚。但是，目前还没有关于将程序降温仪应用于柚种子超低温保存的报道。因此，探索柚类种子的超低温保存方法，研究不同的脱水、降温速率以及预冷末温度等因素对种子超低温保存的影响，有利于丰富柚种子的保存方法，为中间型种子的保存提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

葡萄柚(Citrus paradise)属芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)。实验所用的“小甜柚”是葡萄柚的一个品种，引种自越南，20世纪 60年代由中国科学院西双版纳热带植物园选育成功，在西双版纳有较大的种植面积，为当地一种重要的经济作物。小甜柚树体高大，树势强健，树冠圆头形，枝梢粗壮。果实10月初成熟，耐贮藏[15—16]。

葡萄柚种子均采自位于云南省西双版纳傣族自治州勐腊县勐仑镇的西双版纳热带植物园。为避免环境等因素对实验的影响，种子尽量采自同一片种植园。整个实验共采集成熟的葡萄柚果实约300个。从果实取出种子，室内摊开放置1 d，待种皮稍晾干后，手工剥除外种皮，然后测定种子千粒重、初始含水量和成苗率。剩余种子置于密封袋中放在15 ℃冷库中保存备用，一般保存不超过7 d。

1.2 方法

1.2.1 种子基本参数测定

种子千粒重：随机取样，每次100粒，重复取样10次，使用精度万分之一克的电子天平称重。计算百粒种子的平均重量，然后换算成千粒重。

种子含水量：按国际种子检验协会推荐的油料种子含水量测量方法测定[17]。将种子称鲜重后，置于103±2 ℃烘箱中烘干17±1 h称干重。每处理使用单粒种子的8个重复。含水量计算公式：

种子成苗率：将种子尖端朝上插入1%琼脂，置于30±1 ℃恒温萌发箱中萌发。每20粒为一重复，播种5～6个重复。每周观测一次种子萌发情况，持续3个月。以胚根伸出种皮5 mm为萌发或存活，种子长成形态学上完整的幼苗为成苗。另外，为了防止吸胀伤害，脱水处理的种子在播种前需置于空气湿度接近饱和的环境中吸湿，即将种子放在无盖的小培养皿中，然后把小培养皿放入底部盛有少量水分的大培养皿中，盖上大培养皿，放入30 ℃恒温萌发箱中，24 h后取出播种。

1.2.2 不同脱水速率处理

脱水过程分为两步，第一步是以3种脱水速率将种子脱水至约20%含水量。具体方法：将新鲜的种子分成3份(每份3000粒)，分别单层平铺放置在温度为15 ℃和相对湿度(RH)分别为15%(种子库干燥间1)、50%(种子库干燥间2)、75%(盛有NaCl饱和溶液的保鲜盒)的三种环境下脱水，定期取样测量种子含水量。当含水量达20%左右，进入第二步。

第二步将上述3种脱水处理的种子各分为10份(每份300粒)，分别放入10个盛有不同种饱和盐溶液的聚乙烯保鲜盒中，于15 ℃条件下保存。两周后每周取出种子检测含水量，连续两次测量结果无明显变化后视为达到水分平衡。实验所用10种饱和盐溶液是 KCl (85% RH)、(NH4)2SO4(81% RH)，NH4Cl(78% RH)、NaCl (75% RH)、NaNO3(62% RH)、Mg(NO3)2(54% RH)、K2CO3(45% RH)、MgCl2(34%RH)、CH3COOK (23% RH)和 KOH (8% RH)[18]。

经饱和盐溶液处理的水分平衡的种子分为两小份(每小份120粒)，一小份吸湿处理后直接播种进行活力检测(对照)，另一小份用简单二步法超低温保存后播种。具体作法：先将种子装入约50 mL塑料瓶，放入家用冰箱冷冻室保持 2 h，取出后立即投入液氮，在液氮中贮藏24 h，然后取出，投入50 ℃水浴2～3 min，使其恢复室温。吸湿后检测种子活力[2]。

种子脱水速率按Samarah的方法计算，即：

其中，Si和Si+1分别是样品i和i+1的种子水分含量，di+1是对样品i+1实施干燥处理的天数[19]。

1.2.3 不同降温速率和预冷末温度处理

该实验使用的种子先按上述方法在15 ℃、50%RH干燥间脱水至约 12%含水量，然后使用程序降温仪进行预冷处理。

1.2.3.1 不同降温速率实验

将同一批种子分为10份(每份120粒)，每两份为 1 组，共 5 组，分别以-0.25 ℃·min-1、-0.5 ℃·min-1、-1 ℃·min-1、-2.5 ℃·min-1和-5 ℃·min-1降温速率将种子从 4 ℃冷冻至-40 ℃。完成第一步冷冻(预冷)的两份种子，一份取出后按1.2.2中方法投入50 ℃水浴解冻，然后吸湿、播种(对照)；另一份投入液氮，在液氮中保存24 h后再取出解冻、吸湿、播种。

1.2.3.2 不同预冷末温度实验

将同一批种子分为6份(每份120粒)，每两份为1组，共 3组，以-1 ℃·min-1降温速率分别降至-40 ℃、-50 ℃、-60 ℃，完成预冷。然后再按1.2.3.1中方法完成超低温保存的第二步冷冻(超低温处理)和(或)对照实验的解冻、吸湿、播种。

1.2.4 数据统计分析

用 Microsoft Excel 2010统计数据，GraphPad Prism软件制图，SPSS软件对数据进行方差分析、多重比较、非参数检验；采用概率单位回归方法计算半致死含水量MC50。

2 结果与分析

2.1 不同脱水速率对种子超低温保存的影响

葡萄柚种子平均百粒重40.810g±0.619，千粒重为408.10 g，初始含水量为42.181%。二步脱水的第一步说明不同处理存在明显的脱水速率差异(图1)，其脱水速率指数分别为11.66 (15% RH)，9.06 (50%RH)和3.40 (75% RH)。脱水至约20%后放入10种饱和盐溶液中平衡，平衡后的种子最终含水量为3%～11%(表 1)。

图1 不同环境下种子含水量的变化Fig. 1 Changes in seed moisture contents in different dehydration regimes

随着含水量的降低，脱水后种子的成苗率也不断降低。同时，不同脱水速率处理后的种子的成苗率各有不同，脱水速度越快，种子的脱水敏感性越高。3种空气相对湿度(15%、50%、75%)条件下脱水后的种子成苗率差异显著(P<0.05)，在相对湿度分别为75%、50%、15%环境下脱水的葡萄柚种子中，半致死含水量MC50分别为5.169、6.817、12.514，成苗率呈75% RH>50% RH>15% RH，即相同含水量的种子，脱水速度越慢成苗率越高(表1)。

超低温处理进一步降低了种子的成苗率，超低温保存的种子与脱水对照的种子相比，成苗率有显著差异(P<0.05)(表 1)。含水量对超低温保存后的萌发有重要影响，含水量 6%～8%之间的种子成苗率最高。但是，以不同速率脱水的种子在超低温保存后，种子成苗率总体上没有显著差异(P>0.05)(表1)。不过，在种子含水量7%左右时，超低温保存后成苗率15% RH>75% RH>50% RH，而在75% RH脱水到含水量8%的种子冷冻后成苗率最高，并且远高于15% RH和50% RH。

表1 10种饱和盐溶液平衡脱水后葡萄柚种子含水量及其种子脱水、超低温保存的成苗率Table 1 Moisture content of grapefruit seeds after dehydration in ten saturated salt solutions and the emergence of dehydrated and cryopreserved seeds

2.2 预冷对种子超低温保存的影响

脱水到12%含水量的葡萄柚种子，使用不同的慢速降温速率从4 ℃降至-40 ℃，第一步冷冻后的成苗率有显著差异(P<0.05)，以-2.5 ℃·min-1的速率降温的种子成苗率最高；-5 ℃·min-1降温的种子成苗率最低，并与以-2.5 ℃·min-1、-1 ℃·min-1降温的种子差异显著。放入液氮超低温处理后，总体趋势是随着降温速率的降低成苗率升高，并以-0.5 ℃·min-1和-0.25 ℃·min-1速率降温的种子成苗率较高，分别达到 11.67%和 10.83%。与预冷对照的种子比较，经历超低温处理后的种子成苗率显著降低(P<0.05)，以-2.5℃·min-1降温的种子成苗率变化最大，-0.5 ℃·min-1降温的种子成苗率变化最小(图 2: A)。

预冷末温度方面，以-1 ℃·min-1速率降温至不同末温度，第一步降温后，预冷末温度为-40 ℃的种子成苗率最高，并与-50 ℃和-60 ℃成苗率差异显著(P<0.05)。液氮超低温处理后，预冷到-60 ℃的种子成苗率最高，但与其他温度的种子无显著性差异。液氮冷冻处理显著降低种子成苗率，与预冷对照比较，预冷温度为-40 ℃的种子成苗率变化最大(图2:B)。

图2 不同速率预冷(A)、预冷末温度(B)及其超低温保存后种子成苗率Fig. 2 Emergence of seeds precooled at different cooling rate, final temperatures and cryopreserved

3 讨论

一般对于未完全成熟的正常性种子而言，慢速脱水比快速脱水更有利于提高种子的脱水耐性[20]；而对于顽拗性种子，快速脱水比慢速脱水更好[21]。对于葡萄柚这种中间型种子来说，还需对其脱水条件进一步研究。文彬等[2]对西双版纳柚子10个品种进行研究，所有品种的种子含水量下降至10%时，种子生命力基本不受影响；但是不同品种间种子的脱水耐性也并不一样，使种子生命力受到影响的临界含水量不尽相同，从 7%～9%不等，冷冻种子出苗率22%～86%。张楠等[6]研究葡萄柚种子超低温耐性发育及硅胶快速脱水与饱和盐慢速脱水对超低温保存的影响，表明快速脱水与慢速脱水的种子成苗率差异显著，脱水使种子受到一定的伤害，而且超低温保存后快速脱水比慢速脱水好。本研究中，葡萄柚种子在3种速率慢速脱水之后，成苗率都有一定的降低，且15% RH<50%RH<75%RH；超低温保存后种子的成苗率又进一步降低，说明脱水和冷冻过程都会对种子造成损伤。在慢速脱水的情况下，脱水速度越快对种子造成的伤害越大，但是超低温保存后种子成苗率并无显著差异，即在慢速脱水中脱水速率的变化对超低温保存影响较小甚至没有影响。种子含水量是影响超低温保存的重要因素，6%～8%应是葡萄柚种子超低温保存的最适含水量，与前人的结果相似[6]。

超低温保存的过程中由于会经历剧烈的升温和降温，这种温度的变化可能会在细胞内部形成冰晶，对细胞造成机械损伤以及对细胞膜结构和酶活性造成影响，超低温保存的关键就是要避免这些损伤的发生。玻璃化法是先把材料经过玻璃化处理和(或)以足够快的降温速度使液体玻璃化，避免冰晶的生成。两步降温法是以较慢的降温速度，先从0 ℃降到-30 ℃至-50 ℃的预冷温度，使细胞体外及细胞间隙的溶液先部分冻结，而细胞内尚未结冰，胞外溶液由于结冰溶质浓度不断升高，造成细胞内外溶质浓度差，使得胞内水份通过细胞膜向外渗透，即冷冻脱水，脱去细胞内多余的水分，防止发生冷冻伤害。只要降温速率控制得当，细胞内的水分就能不断地向细胞外扩散，细胞原生质浓缩，从而降低了细胞原生质的冰点，使细胞达到适当的保护性脱水，然后迅速投入液氮之中保存[22]。本研究关注二步法中第一步的降温速率与预冷末温度，相较于原先使用的简易二步法，种子保存后的成苗率有略微提升，说明使用程序降温仪控制降温速率的二步法有助于葡萄柚种子的超低温保存。需要说明的是，本研究中第一步的降温速度和预冷末温度对超低温保存的结果都有影响，但是，由于实验材料的限制，研究中并没有把实验所得的最佳降温速度(-0.5 ℃·min-1和-0.25 ℃·min-1)和最佳预冷末温度(-60 ℃)组合起来，可以在后续的工作中尝试更多的降温速度和预冷末温度组合提高超低温保存后葡萄柚种子的成苗率。

值得注意的是，Zhang等[6]在硅胶快速脱水和饱和盐慢速脱水后超低温保存的比较研究中，快速脱水结果比慢速脱水好；而本研究中，脱水速率对超低温保存结果无影响，这可能是因为本研究虽然采用了3种不同的脱水速率，但是都在慢速脱水的范畴中。在快速脱水与慢速脱水之间可能存在一个临界值，找到这个值有助于完善种子超低温保存方法。另外，在二步法的超低温保存实验中，预冷后的种子跟液氮处理后的种子成苗率差别很大，说明预冷过程可能没有把种子中的自由水分全部移除，在接下来的液氮处理过程中有进一步的伤害发生。