李敏，周潇潇，黄云川，林鑫，李桂黎，李原野，李俐睿

（四川省成都市动物疫病预防控制中心，四川成都 610041）

为了解猪巴氏杆菌病在当前成都地区猪群中的感染和流行情况，2020 年2～12 月，笔者从成都市三个无害化处理厂采集了1 037份病死猪的淋巴结、脾脏和肝脏混合样品，用荧光定量RT-PCR 方法检测猪巴氏杆菌病病原，现将结果报告如下：

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 在成都市三个无害化处理厂，采集来源于成都市18 个区（市）县的病死猪样品（淋巴结、脾脏和肝脏混合样），每月采集1 次，全年共采集混合样品1 037头份。

1.1.2 主要试剂 磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒、猪巴氏杆菌病单重荧光RT-PCR 检测试剂盒，均购自北京世纪元亨生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 向无菌的2 mL Lysing Matrix组织研磨管中加入1 mL PBS液，再加入适量组织混合样品，置于FastPrep-24™5G 研磨仪中研磨30 s，取出置离心机中以8 000 r/min离心1 min，取上清备用。

1.2.2 DNA抽提 采用磁珠法病毒DNA/RNA提取法使用KingFisher DUO 自动化提取仪对病毒DNA 进行提取，执行Tian_KingFisher_Duo.bdz 程序进行DNA 抽提。程序执行完毕，取出DNA，用封口膜封好并保存于-20 ℃备用。

1.2.3 荧光定量RT-PCR 反应 将试剂盒中的PCR 反应液和阴、阳性对照进行瞬时离心，备用。向PCR 反应管内依次加入猪巴氏杆菌PCR反应液20 μL、DNA 模板5 μL，配制成25 μL 反应体系，并设立阴、阳性对照。反应条件如下：37 ℃2 min，95 ℃5min；95 ℃5 s，55 ℃40 s，共40 个循环；在55 ℃延伸时收集荧光信号，报告基团为“FAM”，淬灭基团为“NONE”。

1.2.4 结果判定 若阳性对照Ct 值≤35，阴性对照Ct值＞38或无Ct值，则试验成立。如Ct值≤35并出现特定的扩增曲线，则为猪巴氏杆菌病阳性；如35＜Ct值＜38需重新提取DNA进行扩增，如仍为可疑，则判定为阳性；……