◎ 刘朋宇

（沈阳市食品药品检验所，辽宁 沈阳 110022）

随着人们对高品质生活的追求，鲜活水产品成为购买水产品的首选。在水产品的运输和批发过程中，使用麻醉剂可有效地抑制其过激反应，从而降低物理伤害、减少微生物感染率和维持个体重量。常用的水产品麻醉剂有二氧化碳、间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222）和丁香酚类化合物[1-2]，其中丁香酚和异丁香酚具有价格低廉、麻醉效果好和代谢时间短的特点，近年被广泛应用于水产品的运输和暂养。各国对丁香酚和异丁香酚的监管条例各不相同，其中澳大利亚、日本、智利等国将丁香酚类化合物列为合法的水产品麻醉剂，而出于其存在致癌风险，美国食品药品管理局禁止在水产品中使用丁香酚类化合物作为麻醉剂[3]。我国目前对丁香酚类化合物在水产品的运输和暂养过程中的使用量和残留量没有相应的规定。

丁香酚（Eugenol），化学式为C10H12O2，是无色或淡黄色液体，异丁香酚（Isoeugenol），分子式是C10H12O2，淡黄色微稠厚液体，为丁香酚的同分异构体。目前，测定水产品和暂养水中丁香酚类化合物的方法主要有气相色谱法[4]、液相色谱法[5-6]、气质联用法[7-9]和液质联用法[10-12]，其中气相色谱法和液相色谱法的前处理中存在操作复杂、耗费试剂量大、干扰物难以去除和灵敏度低等缺点。由于丁香酚和异丁香酚为同分异构体，增加了液相色谱质谱法对其分离、确证和结果定量的难度[13]。本实验选用气相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定丁香酚和异丁香酚，能够有效缩短前处理时间、提高效率、减少溶剂使用及降低环境污染，适用于批量检测暂养水中丁香酚和异丁香酚化合物。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

水产暂养水，来源于超市、农贸市场和饭店，装于塑料密封瓶中，放于-18 ℃冰箱中保存，待用。

丁香酚、异丁香酚，纯度均≥98%；正己烷、乙 腈，均为色谱纯；氯化钠，为分析纯。

8890-7000D 气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国安捷伦公司）、MV5 氮吹仪（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）、MS3 涡旋混合器（德国IKA 公司）及H1750 离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）、Quintix224-1CN 电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液和试剂的配制

丁香酚和异丁香酚标准溶液：准确称取丁香酚和异丁香酚纯品各100 mg 于两个100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。分别移取上述溶液用乙腈按照使用需求配制成混合标准工作液。

1.2.2 前处理方法

取暂养水样品，常温解冻，称取10.0 g试样于50 mL 塑料离心管中，加入10 mL 正己烷饱和的乙腈，5 g氯化钠，2 000 r·min-1振荡10 min，4 000 r·min-1离心 4 min，加入乙腈饱和的正己烷，手动振摇1 min， 4 000 r·min-1离心4 min，弃去上层正己烷相，取5 mL乙腈于试管中，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 乙腈，涡旋混合1 min。过0.45 μm 有机滤膜于1.5 mL 样品瓶中，待测定。

1.2.3 气相色谱-质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱：DB-1701（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；升温程序：100 ℃保持1 min，6 ℃·min-1升至200 ℃，25 ℃·min-1升至260 ℃，保持5 min；载气：高纯氦气，流速1 mL·min-1；进样口温度：230 ℃，进样方式：不分流进样，进样量1 μL[7]。

（2）质谱条件。离子源：电子轰击电离源（EI）；离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃；四极杆温度150 ℃；溶剂延迟10 min；碰撞气：氮气1.5 mL·min-1，淬灭气：氦气2.25 mL·min-1。采集方式：多反应监测（MRM）模式，离子监测参数见表1。

表1 丁香酚和异丁香酚MRM 采集条件表

2 结果与分析

2.1 丁香酚和异丁香酚的质谱分析

通过在暂养水中添加丁香酚和异丁香酚，样品经1.2.2 方法处理，采用选择离子扫描（SIM）模式进行测定，结果发现样品中存在较多的干扰物，峰面积与待测组分部分重合，导致无法准确定性和定量，加标样品SIM 色谱图见图1。

通过多反应监测MRM 条件的建立和测定，可有效排除干扰物质对异丁香酚的影响。通过产物离子扫描和更改碰撞电压，确定两者的MRM 采集条件，其中m/z=149 响应值高于m/z=131，但由于m/z=149 存在干扰离子，故选择m/z=131 为定量离子，与翟纹静等人的研究结果一致[14]。加标样品的总离子流（TIC）图和MRM 色谱图见图2。

图1 添加50 μg·kg-1 丁香酚和异丁香酚样品SIM 色谱图

图2 加标样品中丁香酚和异丁香酚的TIC 色谱图和MRM 色谱图

2.2 提取净化

暂养水成分相对简单，根据丁香酚和异丁香酚的极性，将其提取至乙腈中，添加氯化钠盐析，使水中的丁香酚和异丁香酚更充分地转移至乙腈相，乙腈用正己烷饱和，可有效的减少样品中非极性成分的溶解，同时采用正己烷净化，可将水相和乙腈相中的低极性成分分离，起到净化的作用。

2.3 方法的检测限和定量限

将丁香酚和异丁香酚配制成20 μg·L-1、40 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1和500 μg·L-1混合标准工作液。在1.2.3 条件下测定，以浓度为横坐标、定量离子峰面积为纵坐标，得丁香酚的线性方程为：y=52.665 763x-746.691 700，相关系数r=0.997 8：异丁香酚的线性方程为：y=33.295 797x-768.763 021，相关系数r=0.997 6，结果表明，在20 ～500 μg·L-1浓度范围内，两个化合物的线性关系良好。通过在水样中添加10 μg·kg-1丁香酚和异丁香酚，经前处理和测定，MRM 色谱图见图3。按照3 倍信噪比为检出限，10 倍信噪比为定量限，计算得丁香酚和异丁香酚的检出限均为2 μg·kg-1，定量限均为5 μg·kg-1。

2.4 加标回收率和精密度

为了验证方法的准确性和可靠性，在空白水样中添加3 个浓度水平的丁香酚和异丁香酚，每个水平添加6 个平行样，经过样品前处理和测定，加标回收率和精密度（RSD）结果见表2。

2.5 实际样品测定

采用本方法对20 份水产暂养水进行处理和测定，其中3 份样品检出丁香酚，检出范围12 ～55 μg·kg-1，检出最高值为鲤鱼暂养用水，异丁香酚均未检出。

图3 样品中添加10 μg·kg-1 的MRM 色谱图

表2 丁香酚和异丁香酚回收率和精密度表

3 结论

通过对现有前处理和测定方法的优化，本研究建立了测定水产暂养水中丁香酚和异丁香酚残留量的气相色谱-三重四极杆质谱法。相较单级质谱方法，本方法可以有效的去除样品中存在的干扰物质对测定结果的影响，提高了检测的灵敏度，通过测定暂养水中丁香酚和异丁香酚的残留量，即可反应其在水产品中的使用情况，可减少水产品的样本数量、降低操作难度。该方法前处理简单、灵敏度高、抗干扰能力强，适用于快速批量测定暂养水及养殖用水中丁香酚和异丁香酚的残留量。