潘宜久 王连魁 熊 华,2#

宁波市杭州湾医院消化内科1(315336)上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所2

背景：非甾体抗炎药(NSAIDs)广泛应用于临床。随着内镜技术的进步，NSAIDs相关小肠损伤越来越多见，但目前尚无明确有效的防治措施。目的：探讨调节性T细胞(Treg细胞)与Th17细胞失衡在NSAIDs相关小肠损伤中的作用以及血管紧张素1-7 [Ang(1-7)]的保护效应。方法：30只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、模型组和Ang(1-7)治疗组，后两组使用双氯芬酸钠诱导小肠损伤模型。5 d后处死大鼠，取小肠黏膜观察大体和组织学损伤情况；以ELISA法和(或)免疫组化法检测Ang(1-7)以及促炎和抗炎细胞因子水平；流式细胞术分析Treg、Th17细胞占CD4+ T细胞的比例。结果：模型组大鼠小肠黏膜广泛充血、水肿，散在多发糜烂、小溃疡。Ang(1-7)治疗组小肠损伤明显减轻，黏膜轻度充血、水肿，散在少量小糜烂灶。治疗组小肠组织Ang(1-7)、抗炎细胞因子水平、Treg细胞数量和Treg/Th17比值较模型组显著升高，抗炎细胞因子水平和Th17细胞数量较模型组显著降低(P均<0.05)。Pearson相关系数分析显示，小肠黏膜Ang(1-7)含量与Treg/Th17比值呈显著正相关(r=0.847, P<0.05)。结论：Treg/Th17失衡可能是NSAIDs相关小肠损伤的重要发病机制，而Ang(1-7) 可能通过调节Treg/Th17平衡参与保护NSAIDs相关小肠损伤。

非甾体抗炎药(nonsteroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)具有抗炎、解热、镇痛等作用，广泛应用于临床。随着该类药物临床应用的增多，其消化道不良反应越来越受到人们的关注。NSAIDs相关胃肠道损伤可导致溃疡、出血、穿孔等并发症发生[1]。与胃十二指肠损伤不同，NSAIDs引起的小肠损伤症状多为非特异性甚至无症状[2]，因小肠损伤住院治疗的患者多以出血、穿孔、梗阻等严重并发症为首发表现。目前对NSAIDs相关小肠损伤尚无明确有效的防治措施，因此，迫切需要进一步明确损伤发生机制，从而为其临床防治寻找新的策略。

血管紧张素1-7 [angiotensin 1-7, Ang(1-7)]是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system)的新组分，可发挥舒张血管、降低血压、增加局部血流量以及抗炎等作用。有研究[3]表明Ang(1-7)可显著减轻小鼠结肠炎模型的结肠炎症损伤，然而，关于Ang(1-7)对NSAIDs相关小肠损伤是否具有保护作用，目前尚无明确结论。调节性T细胞(Treg细胞)与Th17细胞是一对免疫平衡细胞，正常情况下两者处于动态平衡状态。近年来，多项研究发现Treg/Th17失衡在炎症和自身免疫性疾病的发生、发展中发挥重要作用[4-5]，例如在三硝基苯磺酸(TNBS)实验性结肠炎模型小鼠肠道中存在以Treg/Th17失衡为主导的炎症反应。本研究通过构建双氯芬酸钠诱导的NSAIDs相关小肠损伤大鼠模型，探讨Treg/Th17失衡在NSAIDs相关小肠损伤中的作用以及Ang(1-7)的保护效应，以期为NSAIDs相关小肠损伤的防治提供潜在靶点。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

1. 实验动物：雄性Sprague-Dawley大鼠30只，8周龄，体质量(200±20) g，购自浙江中医药大学动物实验中心(合格证号：2008001664294)，使用该中心提供的标准饲料喂养。动物饲养于独立通气笼盒中，每笼5只，清洁级环境(温度22～26 ℃，湿度50%～60%，适宜光照条件)，自由进食、饮水，专人管理。

2. 主要试剂：双氯芬酸钠(Sigma-Aldrich®, Merck KGaA)；Ang(1-7)(Tocris Bioscience)；Ang(1-7)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-17A、IL-10、转化生长因子-β1(TGF-β1)ELISA试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)；Ang(1-7)兔抗鼠多克隆抗体(Cloud-Clone Corp.)；大鼠CD4 FITC、CD25 APC、CD4 APC、IL-17A PE单克隆抗体，小鼠/大鼠Foxp3 PE单克隆抗体，大鼠IgG2a κ PE同型对照，小鼠IgG2a κ APC同型对照(eBioscienceTM, Thermo Fisher Scientific)。

二、方法

1. 动物分组和模型制备：采用随机数字表法将30只大鼠分为3组：对照组、模型组和Ang(1-7)治疗组，每组10只。参考Cooper等[6]的方法使用双氯芬酸钠制备小肠损伤模型。将100 mg双氯芬酸钠溶于100 mL 0.9% NaCl溶液中，配制l mg/mL溶液，按10 mg·kg-1·d-1的剂量予大鼠连续灌胃5 d。Ang(1-7)治疗组药物剂量参考Tesanovic等[7]的研究，将 9.6 mg Ang(1-7)溶于1 mL灭菌水中，配制成9.6 μg/μL溶液，分别注入10只100 μL胶囊微泵中，于双氯芬酸钠灌胃造模前1 d将胶囊植入大鼠颈背部皮下，以24 μg·kg-1·h-1的速度持续皮下微泵给药至造模结束。对照组予10 mL·kg-1·d-10.9% NaCl溶液灌胃，不作其他处理。5 d后处死各组大鼠，观察腹腔内有无出血、腹水，以及腹水性质和肠道组织粘连情况。

2. 组织病理学检查：分离大鼠小肠组织，肉眼观察大体损伤情况。参考Murano等[8]采用的大体形态损伤评分标准(表1)，评估肠黏膜溃疡和炎症程度。于距回盲部5 cm处向口侧切取两段2 cm长的小肠组织备用(肉眼观有糜烂、溃疡等病变的取病变及其周边组织)，其中一份4%甲醛溶液固定，另一份置入冻存管后液氮保存，随后转入-80 ℃冰箱冻存待测。

表1 肠黏膜大体形态损伤评分标准

小肠组织标本4%甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋、3～4 μm厚连续切片，HE染色，光学显微镜下观察，拍照。参考Chiu氏评分标准[9]进行小肠组织学损伤评分(表2)，每只动物5张切片，每张切片随机观察4个高倍视野(×200)，结果取均值。

表2 肠黏膜组织学损伤Chiu氏评分标准

3. ELISA法检测小肠组织Ang(1-7)和炎症细胞因子水平：参照相应ELISA试剂盒说明书进行操作，以酶标仪测定小肠组织Ang(1-7)、IL-6、IL-17A、IL-10、TGF-β1水平。

4. 免疫组化法检测小肠组织Ang(1-7)表达：石蜡包埋小肠组织3～4 μm厚连续切片，行SP法免疫组化染色，操作步骤参照试剂说明书进行。每只动物5张切片，每张切片于光学显微镜高倍视野(×200)下选取3～5个视野，每视野计数200个以上细胞中的阳性染色细胞数，计算阳性标记指数(阳性标记指数=视野内阳性细胞数/视野内细胞总数×100%)，结果取均值。

5. 流式细胞术检测小肠黏膜Treg、Th17细胞比例：大鼠解剖后迅速取小肠黏膜，0.9% NaCl溶液清洗2～3次，立即置于预冷RPMI1640培养基中，剪碎、研磨、挤压、过滤后得到单细胞悬液，预冷PBS洗涤后离心，调节细胞浓度为2×106/mL，参照试剂说明书进行操作，上流式细胞仪(BD FACSCantoⅡ)检测Treg、Th17细胞占CD4+T细胞的比例。

三、统计学分析

结 果

一、腹腔和小肠组织大体观察

对照组大鼠小肠黏膜光滑，无充血、水肿，无糜烂、溃疡。模型组大鼠造模第3天死亡1只，解剖后见大量血性腹水和肠穿孔；其余大鼠小肠黏膜广泛充血、水肿，散在多发糜烂、小溃疡，偶见小穿孔，伴肠系膜淋巴结肿大，损伤多在系膜侧。Ang(1-7)治疗组大鼠小肠损伤明显减轻，黏膜轻度充血、水肿，散在少量小糜烂灶，未见明显溃疡和穿孔。模型组大体损伤评分较对照组明显升高，Ang(1-7)治疗组评分则较模型组明显降低，差异均有统计学意义(P均<0.05；图1、表3)。

图1 各组大鼠小肠大体损伤

二、小肠组织病理学改变

对照组大鼠小肠黏膜结构未见明显缺损和异常，绒毛排列整齐。模型组大鼠小肠黏膜缺损，部分绒毛倒伏、缺失，上皮坏死严重，可见溃疡，固有层水肿明显，伴大量炎症细胞浸润。Ang(1-7)治疗组大鼠小肠绒毛轻度水肿、增粗，偶见上皮层小缺损，固有层内少量炎症细胞浸润。模型组组织学损伤评分较对照组明显升高，Ang(1-7)治疗组评分则较模型组明显降低，差异均有统计学意义(P均<0.05；图2、表3)。

图2 各组大鼠小肠组织病理学改变(HE染色，×100)

表3 各组大鼠小肠组织大体和组织学损伤评分比较

三、小肠组织Ang(1-7)表达水平变化

ELISA法和免疫组化法检测显示，模型组大鼠小肠组织Ang(1-7)含量和阳性标记指数均较对照组明显降低，Ang(1-7)治疗组相应数据则较模型组明显升高，差异均有统计学意义(P均<0.05；表4、图3、图4)，表明外源性Ang(1-7)干预可升高小肠组织中的Ang(1-7)表达水平。

表4 各组大鼠小肠组织Ang(1-7)表达水平比较

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01

图4 各组大鼠小肠组织Ang(1-7)表达免疫组化染色图

四、小肠组织炎症细胞因子水平

ELISA法检测显示，模型组大鼠小肠组织IL-6、IL-17A水平较对照组明显升高，IL-10、TGF-β1水平较对照组明显降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)；Ang(1-7)治疗组IL-6、IL-17A水平较模型组明显降低，IL-10、TGF-β1水平较模型组明显升高，差异均有统计学意义(P均<0.05；表5、图5)。

表5 各组大鼠小肠组织炎症细胞因子水平比较

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

五、小肠黏膜Treg/Th17比值

流式细胞分析显示，模型组大鼠小肠黏膜Treg、Th17细胞占CD4+T细胞的比例均较对照组明显增加，但Treg/Th17比值较对照组明显降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)；Ang(1-7)治疗组Treg细胞比例较模型组明显升高，Th17细胞比例较模型组明显降低，Treg/Th17比值较模型组明显升高，差异均有统计学意义(P均<0.05；表6、图6)。

表6 各组大鼠小肠黏膜Treg、Th17细胞比例和Treg/Th17比值比较

图6 各组大鼠小肠黏膜Treg、Th17细胞比例(流式细胞分析)

六、小肠组织Ang(1-7)含量与Treg/Th17比值的相关性

Pearson相关系数分析显示，小肠黏膜组织中的Ang(1-7)含量与Treg/Th17比值呈显著正相关(r=0.847,P<0.05)。

讨 论

NSAIDs在临床实践中广泛应用于急慢性炎症，如风湿性关节炎、骨关节炎等疾病的治疗。其中阿司匹林因其稳定的抗血小板凝集作用，已成为心脑血管疾病的一级预防用药。此外，其对结直肠癌也有一定的预防作用[10]。然而，随着该类药物适应证的扩大，其不良反应尤其是胃肠道不良反应的发生率逐渐增加。早年由于检查手段的限制，对NSAIDs相关胃肠道不良反应的研究主要集中于胃十二指肠损伤，近年来，由于质子泵抑制剂(PPIs)、黏膜保护剂等的使用，胃十二指肠黏膜损伤的发生率明显下降，但此类药物对包括小肠在内的下消化道损伤并无明确防治作用，甚至有研究表明，长期预防性使用PPIs可能通过影响肠道菌群增加小肠隐匿性出血和溃疡发生率[11]。近年来，随着内镜技术的进步，如胶囊内镜的应用，NSAIDs相关小肠损伤越来越多见，在长期服用NSAIDs的患者中，约50%存在小肠黏膜损伤[2]。而且，大部分NSAIDs相关肠病患者无临床症状，需住院治疗者多以出血、穿孔、梗阻等严重并发症为首发表现。NSAIDs相关肠病的发病机制复杂，迄今尚未完全明确，既往多聚焦于三级打击学说、环氧合酶(COX)双重抑制学说、NSAIDs的肝肠循环以及肠道菌群变化等方面[12]，目前临床上缺乏有效的防治措施。因此，进一步明确NSAIDs相关小肠损伤的发病机制是迫切需要解决的问题。

Th17细胞和Treg细胞均由初始CD4+T细胞增殖分化而来，前者主要通过分泌IL-17A、IL-21等细胞因子参与机体自身免疫和炎症反应，后者则通过分泌IL-10、TGF-β1等细胞因子抑制免疫炎症反应，维持机体的免疫耐受。正常情况下两者处于一种动态平衡状态，对维持机体免疫稳态起重要作用。维甲酸受体相关孤核受体γt(RORγt)和叉头蛋白3(Foxp3)分别是参与调控Th17和Treg细胞分化的特异性转录因子[13]，Foxp3缺乏可导致Treg细胞分化减少，从而引发过度免疫反应，造成组织损伤。除促进Th17细胞分化、产生大量IL-17A外，RORγt还可抑制T细胞产生IL-10，从而维持Th17细胞的致病性[14]。Treg/Th17平衡在不同疾病模型和病情阶段存在不同的变化趋势。综合相关研究结果，在炎症初发和进展阶段，机体和局部免疫水平上调，Treg和Th17细胞数量均有不同程度的增加，整体上以Th17细胞增加为主，通过分泌IL-17A等促炎细胞因子促进炎症发生、发展；至炎症后期和修复阶段，Th17细胞比例明显降低，Treg细胞比例逐渐升高，通过分泌IL-10等抗炎细胞因子抑制炎症持续，促进机体和局部组织修复。近年已有一系列关于Treg/Th17平衡在炎症性肠病等疾病中作用的研究发表[4-5,15]，但其与NSAIDs相关小肠损伤之间的关系尚无确切结论。本研究发现，在双氯芬酸钠诱导的大鼠小肠损伤模型中，Th17细胞占CD4+T细胞的比例显著上升，尽管Treg细胞比例也较对照组升高，但Treg/Th17比值较对照组明显下降，表明NSAIDs相关小肠损伤时存在Treg/Th17失衡。模型组大鼠小肠组织IL-6、IL-17A表达升高，IL-10、TGF-β1表达降低，表明在NSAIDs相关小肠损伤中，Treg/Th17失衡致促炎/抗炎细胞因子失衡，进而促进炎症进展，造成组织损伤。

Ang(1-7)是肾素-血管紧张素系统的新组分，具有明显的抗炎效应，可减轻结肠炎、哮喘等疾病动物模型的炎症程度[3,16-17]。Ang(1-7)在体内主要由AngⅡ水解产生，与其特异性受体MAS结合后发挥抗炎、舒张血管、降低血压等与AngⅡ相反的生物学功能，因而被认为是AngⅡ的内源性拮抗剂[18-19]。本研究予模型大鼠外源性Ang(1-7)干预，探究Ang(1-7)在NSAIDs相关小肠损伤中的作用及其可能机制。实验结果显示，经Ang(1-7)干预的模型大鼠小肠组织Ang(1-7)表达水平明显升高，大体和组织学损伤较模型组明显减轻，Th17细胞占CD4+T细胞的比例以及IL-6、IL-17A水平亦较模型组明显降低，同时Treg细胞比例、Treg/Th17比值以及IL-10、TGF-β1水平较模型组明显升高，且小肠组织中的Ang(1-7)含量与Treg/Th17比值呈显著正相关，表明Ang(1-7)对NSAIDs相关小肠损伤具有保护作用，此种保护作用可能与调节Treg/Th17平衡有关，相关信号通路和分子机制尚待进一步研究。

综上所述，本研究发现NSAIDs相关小肠损伤时存在Treg/Th17失衡，这可能是NSAIDs相关小肠损伤的重要发病机制；Ang(1-7)对NSAIDs相关小肠损伤具有保护作用，其机制可能与调节Treg/Th17平衡有关，Treg/Th17平衡可能是防治NSAIDs相关小肠损伤的潜在靶点。后续研究拟通过干预Treg/Th17相关细胞因子，为NSAIDs相关肠病的临床治疗提供新的思路。