周学智，张 洋，张亚梅，涂梅琳，杨晓刚，庄田畋

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

良性前列腺增生症(BPH)是一种常见的男性泌尿系统疾病，患者多伴有进行性尿频、尿急、夜尿次数增多、排尿困难等症状，严重者将导致尿潴留、肾结石、肾积水、肾功能不全等并发症。流行病学观察发现[1]，50岁以上男性是BPH的高发人群，且80岁以上老年男性患病率高达95%。随着人口老龄化逐渐加重，BPH的患病人数逐年增多，将给社会带来巨大的经济负担[2]。现代医学研究表明BPH发病因素与机体内激素水平异常、炎症反应及前列腺间质细胞增殖密切相关。临床常采用抗雄激素药物及手术切除方法改善患者症状，但易引起头晕、头痛、乏力、困倦、体位性低血压、异常射精等不良反应的发生率[3]。中医药在治疗BPH方面发挥独特的优势，能够明显缩小前列腺体积，还可降低患者并发症的发生率、提高患者生活质量[4]。

淫羊藿( Epimedii Folium)是小蘗碱科草本植物，又称仙灵脾，其主要化学成分为木脂素类、黄酮类、酚苷类、生物碱类等。《神农本草经》首次记载淫羊藿并将其列为中品，并提出其具有主阴痿绝伤、茎中痛、利小便的作用。淫羊藿是常用的补肾阳中药，古代医家常将其用于男科疾病的治疗。现代药理研究发现，淫羊藿及其主要化学成分具有抗炎、抗氧化、调节性激素水平和调控自噬等作用，并在BPH的治疗过程中发挥积极作用[5]，徐薇等提出淫羊藿的主要化学成分对小鼠睾丸组织具有较好的保护作用，还可提升肾阳虚患者体内睾酮的含量[6]。涂梅琳等发现淫羊藿苷能够通过抑制自噬过程来减轻BPH模型大鼠的前列腺体积和湿重等增生状况[7]。

网络药理学是一门运用系统生物学方法进行药理学研究的新兴学科，基于“疾病-靶点-药物”相互作用的网络，系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响，强调对信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果，降低毒副作用，从而提高新药临床试验的成功率，节省药物的研发费用。本研究运用网络药理学方法研究淫羊藿治疗BPH的作用机制，为后续实验提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件

本研究借助的数据库和软件包括TCMSP数据(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)、Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)、DisGeNET数据库(https：//www.disgenet.org/)、String数据库(https：//string-db.org/)、DAVID 数据库(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)、Cytoscape 3.6.0软件、R软件和perl软件。

1.2 化合物筛选及靶点收集

利用TCMSP数据库，以“淫羊藿”为关键词检索化合物，依据口服生物利用度( oral bioavailablity，OB)>30%和类药性(drug likeness，DL)>0.18的原则筛选有效化学成分及其靶点。有效化学成分的作用靶点经Uniprot数据库比对后确认标准化名称[8]。

1.3 良性前列腺增生症的靶点预测

使用DisGeNET数据库搜索关键词“Benign prostatic hyperplasia”，获取良性前列腺增生症的相关作用靶点[9]。借助R语言制作淫羊藿和BPH的靶点Venn图，并通过Cytoscape 3.6.0软件构建淫羊藿有效化学成分-BPH-靶点网络。

1.4 蛋白互作网络(PPI)构建

在String数据库中输入交集靶点，并设定物种为“Homo sapiens”，构建淫羊藿治疗BPH的蛋白互作网络( protein-protein interaction，PPI)[10]。借助Cytoscape 3.6.0软件的“Network Analysis”获取网络度值(degree)，以确定关键靶点。

1.5 生物学功能和通路分析

将交集靶点导入DAVID数据库，并设定物种为“Homo sapiens”，进行基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析[11]。最后，通过R语言绘制GO功能和KEGG通路气泡图。

2 结果

2.1 淫羊藿化合物筛选及靶点收集结果

利用TCMSP 数据库寻找淫羊藿的有效化学成分，共收集到130个化学成分，依据OB>30%，DL>0.18的标准，获得22个有效化学成分和106个靶点。淫羊藿有效化学成分基本信息见表1。由Cytoscape 3.6.0软件制作淫羊藿有效化学成分-靶点网络图，如图1所示。其中涉及232条边和126个节点，圆形表示靶点，菱形为活性化合物。

表1 淫羊藿有效化学成分基本信息表Tab.1 Basic information of effective chemical components of Epimedii Folium

图1 淫羊藿有效化学成分-靶点网络图Fig.1 Epimedii Folium effective chemical components-targets network

2.2 良性前列腺增生症的靶点预测

根据关键词，在DisGeNET数据库中获取BPH相关靶点770个，并将其与淫羊藿有效化学成分对应靶点取交集后得到44个靶点，如图2所示。由Cytoscape 3.6.0 软件制作淫羊藿有效化学成分-BPH-靶点网络图，如图3所示。其中涉及141条边和60个节点，44个圆形表示靶点，15个菱形为活性化合物，1个四边形为BPH。利用Network Analysis功能对网络分析degree值前3名的化合物为quercetin(槲皮素)、kaempferol(山柰酚)、luteolin(木犀草素)，见表2。

图2 淫羊藿有效化学成分治疗BPH的相关靶点韦恩图Fig.2 Wayne map of the targets of effective chemical components of Epimedii Folium in the treatment of BPH

图3 淫羊藿有效化学成分-BPH-靶点网络图Fig.3 Epimedii Folium effective chemical components-BPH-targets network

表2 核心化学成分degree值Tab.2 Degree values of core chemical components

2.3 蛋白互作网络(PPI)构建结果

采用String数据库对筛选出的交集靶点进行PPI网络分析，将PPI中得分大于0.4的靶点数据输入Cytoscape3.6.0软件进行Network Analysis功能分析，绘制出交集靶点的PPI 网络图，如图4所示。PPI网络中节点的形状越大表示degree值越高，该节点的作用越强，其中degree值前3名的靶点为TP53、ESR1、IL6，见表3。

图4 淫羊藿治疗BPH靶点的PPI 网络Fig.4 PPI network of Epimedii Folium in the treatment of BPH

表3 核心靶点degree值Tab.3 Degree values of core targets

2.4 生物学功能和通路分析结果

44个交集靶点富集了1173个生物学过程(P<0.05)，选取P值排名前20的功能信息，如图5A、5B、5C。富集结果显示交集靶点主要富集在雌激素反应(response to estradiol)、腺体发育(gland development)、蛋白激酶结合(protein kinase binding)等过程。KEGG分析结果共有39条KEGG通路参与其中，如图5D所示，主要涉及HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、PI3K-Akt 信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、JAK-STAT信号通路(Jak-STAT signaling pathway)、VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)、 ErbB信号通路(ErbB signaling pathway)等。

图5 淫羊藿治疗BPH的GO富集和KEGG通路气泡图Fig.5 Bubble diagram of GO enrichment and KEGG pathway of Epimedii Folium in the treatment of BPH

3 讨论

中医学认为BPH属“癃闭”等范畴，其病机主要为肾气不足、瘀血阻络。《诸病源候论》指出肾气不足，封藏失职，导致小便频数而清长或淋漓不尽；肾藏一身阳气，肾阳不足，则无力蒸化水液，致使膀胱开阖不利进而发展为尿闭。淫羊藿具有扶阳固本，补肾填精之功效。目前，临床上常用淫羊藿治疗男性泌尿系统疾病，尤其可缓解BPH患者尿频、夜尿次数增多和排尿困难等症状。但其具体作用机制尚不明确，因此本研究利用网络药理学探讨淫羊藿治疗BPH的作用机制。对“淫羊藿有效化学成分-BPH-靶点”网络分析，degree值排序前3名的有效化学成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素，故推测这可能是淫羊藿治疗BPH的关键有效成分。槲皮素是黄酮类化合物的主要代表，具有抗癌、抗炎、抗糖尿病和抗微生物活性等多种作用，并可延缓BPH的发展进程。睾丸激素和致癌物(MNU)诱导的BPH大鼠经槲皮素治疗后可显著降低睾丸腹侧和背外侧区域的发病率[12]。山奈酚又名百蕊草素Ⅲ，属于黄酮类化合物，广泛存在于各种水果、蔬菜及饮料中，在治疗和缓解BPH的症状过程中发挥重要作用[12]。此外，山奈酚能够通过抑制前列腺癌细胞的雄激素信号通路(如：AR、PSA、TMPRSS2和TMEPA1)的表达进而加速其凋亡的进程[13]。木犀草素存在于大量植物中，对肿瘤、过敏性疾病和生殖系统疾病具有较好的治疗作用。在BPH的治疗过程中，木犀草素可以通过抑制AR、ERα表达，降低血清中雌二醇(E2)、二氢睾丸酮(DHT)的水平进而达到治疗BPH的目的[14]。因此，槲皮素、山奈酚、木犀草素3个化学成分可能在淫羊藿治疗BPH中发挥关键作用。

采用String数据库对筛选出的交集靶点进行PPI网络分析，其中degree前3名的靶点为TP53、ESR1、IL6。TP53又称p53基因，是一个高突变性基因，对前列腺功能具有一定的调节作用。BPH患者体内呈现大量p53基因的突变会增加前列腺癌的产生风险[15]。ESR1也称为雌激素受体α(ESRα)，是雌激素受体的两种亚型之一，与前列腺增生存在密切关联性。ESRα具有一定的多态性，其中Xbal和PvuII是2个最常见的多态性位点，可使BPH患者的前列腺组织发生增生性改变，增加癌变的风险[13]。IL6是一种多效性细胞因子，能够通过类固醇生成酶的活化来诱导前列腺内睾丸激素产生，还可刺激前列腺癌细胞的增殖和引起前列腺组织损伤[16]。因此，TP53、ESR1、IL6可作为BPH潜在的治疗靶点。

GO富集和KEGG通路分析发现交集靶点主要富集在雌激素反应、腺体发育、蛋白激酶结合等过程和HIF-1、p53、PI3K-Akt、JAK-STAT、VEGF、ErbB等信号通路。睾丸分泌的雄激素具有促进腺体发育的作用，且前列腺的腺体发育情况在BPH临床诊疗中占有重要地位[17]。蛋白激酶是一类主要的细胞内信号分子，可延缓BPH的发展进程[18]。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是由HIF-1α和HIF-1β亚基组成的转录因子，在缺氧反应中起关键作用。值得注意的是，HIF-1α 在高度增生的前列腺组织中表达增加，并与前列腺重量密切相关，可作为BPH的独立危险因素之一[19]。BPH与前列腺上皮细胞衰老存在高度关联性，p53信号通路可促进细胞衰老、凋亡和周期停滞等一系列细胞应激反应，进而调控睾丸生殖细胞的DNA损伤[20]。PI3K-AkT通路的过表达可促使前列腺增大，给予BPH模型大鼠PI3K/AKT抑制剂治疗后可显著降低前列腺湿重和前列腺指数[21]。据报道JAK-STAT和VEGF是IL6的主要下游信号通路[22]，将VEGF通路抑制剂给予BPH模型大鼠治疗后可显著减少前列腺重量、大小及前列腺组织的厚度[23]，调控JAK/STAT1信号通路可延缓前列腺细胞产生炎症反应[24]。雌激素在BPH的发病过程中发挥关键性作用，其主要包括ERα和ERβ两种受体形式，ERα主要存在于前列腺基质细胞，ERβ主要表达于前列腺上皮[25]，且原代前列腺基质细胞经雌激素干预后对炎症因子的表达产生一定的调节作用[26]。因此，雌激素反应、腺体发育、蛋白激酶结合等过程和HIF-1、p53、PI3K-Akt、JAK-STAT、VEGF、ErbB等信号通路可作为淫羊藿治疗BPH的潜在机制。

4 结论

综上所述，本研究通过网络药理学初步预测淫羊藿治疗BPH的分子机制，发现淫羊藿治疗BPH有效成分及作用机制呈现多成分、多靶点、多通路的特性。研究发现，淫羊藿中的槲皮素、山柰酚和木犀草素等化学成分，TP53、ESR1和IL6等核心靶点，雌激素反应、腺体发育、蛋白激酶结合等过程和HIF-1、p53、PI3K-Akt、JAK-STAT、VEGF、ErbB等信号通路是淫羊藿治疗BPH的潜在作用机制。但网络药理学方法仅对药物治疗疾病进行预测，存在一定的局限性，后续课题组仍需借助动物实验和临床试验进一步验证淫羊藿治疗BPH的具体作用机制。