严福林，穆巧巧，杨川力，李聪利，覃春叶，孙庆文，魏升华

(贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025)

南沙参为我国常用大宗药材，药用历史悠久，其应用始载于《神农本草经》，名沙参，列为上品，具有养阴清肺、生津益胃、益气化痰等功效，用于治疗肺热燥咳、阴虚劳嗽、食少呕吐等疾病[1]。2015版《中国药典》一部收载南沙参(Adenophorae Radix)来源于桔梗科(Campanulaceae)植物沙参AdenophorastrictaMiq或轮叶沙参Adenophoratetraphylla(Thunb.)Fisch.的干燥根[2]。杏叶沙参、无柄沙参、石沙参等其余种类在其产地亦作药用[3]。

现代研究表明，南沙参含有丰富的多糖、香豆素、甾醇、挥发油、萜类、酚酸类等化学成分，具有显著的抗衰老、抗氧化、免疫调节、抗辐射、镇咳祛痰等药理作用[4-6]。其中，南沙参多糖对老龄小鼠的肝和脑组织中脂褐素的形成、血清中MDA的产生具有一定的抑制作用；可提高小鼠单胺氧化酶、全血GSH-PX和红细胞中SOD的活性，增加血清中的睾酮含量，从而表现出一定的抗衰老作用；南沙参多糖对小鼠超氧自由基和羟自由基具有清除作用，具有肺癌抑制作用；改善和调节小鼠学习记忆障碍；南沙参多糖还具有一定的保肝功效及抗真菌药理作用[7-11]。因此，南沙参多糖是南沙参药材中的最为重要药效成分，其在应用中的提取率直接影响着南沙参药材的利用率与有效性。目前，南沙参多糖的研究主要集中在药理作用方面，提取方法与含量测定方面的研究鲜有报道。据查阅，在南沙参多糖分离工艺与回流提取方法及降解方面有了初步研究[12-13]。

本研究在单因素试验设计法基础上，应用响应面设计法对南沙参多糖进行提取方法、料液比、提取时间、提取温度、提取功率等因素进行优化，以提高南沙参多糖的提取率，以丰富南沙参药材的研究资料，为南沙参的开发利用与进一步研究提供参考。

1 实验材料与仪器

1.1 试验材料

实验材料均为野生，采自贵州境内，经贵阳中医学院魏升华教授鉴定为桔梗科植物轮叶沙参Adenophoratetraphylla(Thunb.)Fisch.的干燥根，切片，60 ℃烘干，粉粹，过60目筛，备用。收集的种源种植于贵阳中医学院中药民族药种质资源圃，凭证标本保存于贵阳中医学院中药材种植(养殖)与加工研究所，具体信息见表1。

表1 药材的采集信息Tab.1 Collection information of the medicinal materials

1.2 实验仪器与试剂

仪器：紫外可见分光光度计(UV-7200，日本岛津公司)，恒温水浴锅(HH-4，常州国华电器有限公司)，粉碎机(FW135，天津市泰斯特仪器有限公司)，离心机，电热鼓风干燥箱，万分之一分析天平(METTLER TOLEDO)，微波炉(格兰仕)，超声提取仪(Scientz-250c，宁波新艺)。试剂：无水葡萄糖(20170321，成都金山化学试剂有限公司)，浓硫酸(20160822，重庆川东化工集团有限公司)，苯酚、乙醇、正丁醇、丙酮(国药集团化学试剂有限公司)，蒸馏水等，实验试剂均为分析纯，实验用水均为蒸馏水。

2 实验方法

2.1 试液配制

苯酚溶液配制：精密称取苯酚4.00 g于100 mL的容量瓶中，加入蒸馏水定容后摇匀，配制成浓度为4 mg/mL的苯酚溶液。葡萄糖溶液(标准品)配制：精密称取恒重(105 ℃)后的无水葡萄糖100 mg于1000 mL容量瓶中加入蒸馏水定容摇匀，配制成浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。Sevag试剂：精密量取正丁醇与氯仿，配制成体积比为1∶4的混合液，混匀，备用。

2.2 南沙参药材多糖提取与提取率测定

精密称取南沙参药材粉末15份，每份5.0 g，于15个250 mL的烧杯中，各加入150 mL乙醇(90%)于室温下静置浸泡12 h，进行脱脂处理。过滤，弃上清液，滤渣进行提取处理(详见表2)。

表2 南沙参药材多糖提取方法Tab.2 Extraction methods of polysaccharide from Adenophorae Radix

提取完成后，减压抽滤，收集滤液，60 ℃蒸发浓缩至10 mL体积(体积少于10 mL免浓缩)后4000 r/min离心10 min，取上清液加1/5体积的Sevag试剂(正丁醇∶氯仿=1∶4)摇匀，4000 r/min离心10 min，去除中间蛋白层，反复操作2次，取上清液加入4倍体积乙醇(95%)，封口胶封口后于5 ℃的冰箱中静置24 h后减压抽滤，得白色或乳白色的沉淀物，最后依次用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，60 ℃干燥，精密称定即得南沙参粗多糖质量(MX)，待用。

精密称取南沙参粗多糖5.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容摇匀，用移液管取该溶液0.6 mL于10 mL具刻度的比色试管用蒸馏水补足2.0 mL摇匀，即得样品溶液，测定其多糖浓度(c)。按照公式(1)计算多糖得率。

多糖得率=c×MX/300×100%

(1)

式中：c-样品稀释液对应的多糖质量浓度(mg/mL)；MX-中药材中南沙参粗多糖质量(mg)。

2.3 响应面法实验设计

结合单因素试验结果，以南沙参多糖提取率为响应值，利用Minitab 16软件，采取中心复合设计原理，设计微波提取下3因素(时间、火力、料液比)、3水平的响应面试验，确定中心试验点。实验因素、水平及中心复合设计实验方案见表3。

表3 中心复合设计Tab.3 Central composite design

应用Design-Expert 8.0软件进行响应面试验设计，详见表4。

表4 响应面法实验设计Tab.4 Response surface experiment design

2.4 标准曲线绘制

采用苯酚-浓硫酸法，精密量取2.1下葡萄糖溶液0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL，分别加入10 mL有刻度的比色试管中，用蒸馏水补足2 mL，依次加入现配的4%苯酚1.0 mL、浓硫酸5.0 mL，摇匀，室温放置30 min。以苯酚和浓硫酸同上操作为空白对照，于490 nm波长下测定其吸光度。标准曲线见图1，该标准曲线的线性良好，回归方程为：Y=55.817X+0.0164，R2=0.9983，r=0.999。

图1 标准曲线图Fig.1 Standard curve

2.5 批次验证试验

依据数据分析结果，采用优选的提取方法对不同产地6个批次的南沙参药材样品进行多糖提取，以验证该提取方法的稳定性与可靠性。

2.6 统计学分析

试验数据采用Microsoft Excel 2010进行分析与作图，应用SPSS19.0对数据进行统计学比较分析，P<0.05具有显著性差异。

3 结果与分析

3.1 不同提取方法对南沙参多糖提取率的影响

取同一批次南沙参药材，按照2.2项下方法进行提取测定，每组进行3次重复试验，提取次数均为1次，计算各方法下南沙参多糖提取率。结果显示，微波提取法南沙参多糖提取率最高，为8.85%，显著高于其他的提取方法，比较具有显著性差异(P<0.05)，且相对平均标准差最低，RSD=0.150%；其次为微波辅助回流提取法，提取率为7.72%，RSD=0.155%；回流提取法对南沙参多糖的提取率最低，提取率=5.60%，相对平均标准差最高，RSD=0.210%。可见，在相应的条件下微波提取法对南沙参多糖的提取效果最优(表5)。

表5 不同提取方法南沙参多糖提取率Tab.5 Extraction rates of polysaccharid from Adenophorae Radix by different extraction

3.2 提取功率对南沙参多糖提取率的影响

以提取时间为90 min、料液比=1∶30(g/mL)、提取次数为1次，按照2.2项下方法进行提取，考察微波提取方法下提取功率100 W、300 W、500 W、700 W、900 W对南沙参多糖提取率的影响。结果显示，当微波提取功率在100～700 W范围内，南沙参多糖提取率从(6.08±0.198)%升高至(8.85±0.150)%，700 W功率下的南沙参多糖提取率显著高于其他功率，比较具有显著性差异(P<0.05)；当提取功率>700 W时，南沙参多糖提取率呈下降趋势，到900 W时，提取率降低为(8.04±0.221)%，与500 W功率下的提取率相当。结果表明，当提取功率为700 W时，南沙参多糖的提取率较高(图2)。

图2 微波提取功率对南沙参多糖提取率的影响Fig.2 Influence of microwave extraction power on extraction rate of polysaccharide from Adenophorae Radix

3.3 提取时间对南沙参多糖提取率的影响

以提取功率为700 W，料液比=1∶30(g/mL)，提取次数为1次，按照2.2项下方法进行提取，考察微波提取方法下提取时间30 min、60 min、90 min、120 min、150 min对南沙参多糖提取率的影响。结果显示，提取时间在30～90 min范围内，南沙参多糖提取率呈现的是上升趋势，从(5.48±0.141)%上升到(8.85±0.150)%；90～120 min阶段，南沙参多糖提取率比较无显著性差异(P>0.05)。当提取时间超过120 min时多糖提取率呈下降趋势，因此，从节约高效方面考虑，提取时间为90 min时即可获得较高的南沙参多糖提取率(图3)。

图3 微波提取时间长度对南沙参多糖提取率的影响Fig.3 Influence of microwave extraction time on extraction rate of polysaccharide from Adenophorae Radix

3.4 料液比对南沙参多糖提取率的影响

以提取功率为700 W，提取时间为 90 min，提取次数为1次，按照2.2项下方法进行提取，考察微波提取方法下料液比变量1∶10(g/mL)、1∶20(g/mL)、1∶30(g/mL)、1∶40(g/mL)、1∶50(g/mL)对南沙参多糖提取率的影响。结果显示，料液比在1∶10～1∶40(g/mL)范围内，南沙参多糖提取率呈上升趋势，从(4.15±0.342)%上升到(9.13±0.334)%；料液比1∶40～1∶50(g/mL)阶段，南沙参多糖提取率呈下降趋势，但料液比1∶30(g/mL)、1∶40(g/mL)、1∶50(g/mL)三组多糖提取率相互比较，均无显著性差异(P>0.05)。因此，从节约高效方面考虑，料液比为1∶30(g/mL)时即可获得较高的南沙参多糖提取率(图4)。

图4 提取料液比对南沙参多糖提取率的影响Fig.4 Influence of material/liquid ratio on extraction rate of polysaccharide from Adenophorae Radix

3.5 提取次数对南沙参多糖提取率的影响

以提取功率为700 W，提取时间为90 min，料液比为1∶30(g/mL)，按2.2项下方法进行提取，考察微波提取方法下提取次数1次、2次、3次对南沙参多糖提取率的影响。结果显示，提取次数1～3次范围内，南沙参多糖提取率呈上升趋势，提取率分别为(8.85±0.150)%、(9.06±0.106)%、(9.11±0.119)%，三组多糖提取率相互比较，1次组与2次组比较，2次组与3次组比较，均无显著性差异(P>0.05)，提取1次组与2次组比较具有显著性差异(P<0.05)。因此，从节约、高效、便捷方面考虑，提取次数选择1次提取，即可获得较高的南沙参多糖提取率(图5)。

图5 提取次数对南沙参多糖提取率的影响Fig.5 Influence of extraction times on extraction rate of polysaccharide from Adenophorae Radix

3.6 响应模型方程的建立与显著性检验

依据响应面试验方案，南沙参多糖提取率情况详见表6。使用Design Expert 8.0.5对提取结果进行二次多项式逐步回归拟合，得回归方程为：

Y=7.52-0.11A+0.77B-0.27C+0.095AB+0.025AC-0.18BC-0.089A2+1.40B2+0.41C2(A-时间，min；B-火力，W；C-料液比，g∶mL)。

对回归模型进行显著性检验，详见表7。结果显示，F=8.56，P>F，表明该模型显著。由模型拟合的回归方程R2=0.998，表明此回归方程成立。模型验证显著，失拟性检验不显著，表明该方程对试验拟合程度较好，可以用于微波提取南沙参多糖的优化。

表6 响应面法试验南沙参多糖提取率Tab.6 Extraction rate of polysaccharide from Adenophorae Radix by response surface method

表7 方差分析结果Tab.7 Results of variance analysis

3.7 交互作用分析与提取工艺确定

根据二次模型分析两因素交互作用对南沙参多糖提取率的影响，结果见图6。如图所示，AC交互作用对南沙参多糖提取率的影响无显著性，而AB、BC的交互作用对南沙参多糖提取率影响呈极显著性。由多元回归方程模型得微波提取法的最佳工艺条件为：提取时间85 min，提取火力700 W档，提取料液比1∶35 g/mL，南沙参多糖提取率为10.50%。

图6 两因素交互作用对南沙参多糖提取率的影响Fig.6 Effects of interaction between two factors on extraction rate of polysaccharides from Adenophorae Radix

3.8 最佳条件验证试验

上述数据分析结果可知最优提取工艺的条件，进行6组平行试验，南沙参多糖提取率为(10.486±0.791)%，实测值与预测值相差0.80%，实测值与预测值的偏差1.44%，结果较为理想(表8)。

4 讨论

南沙参多糖是南沙参药材中的主要药效成分，现代研究表明，南沙参多糖具有显著的抗衰老、抗癌、抗氧化、免疫调节、保肝及抗真菌等药理作用[4-6]，南沙参多糖的提取效率直接影响着南沙参药材的有效性与利用率。目前，对多糖的提取研究主要有水提醇沉、微波提取、超声、煎煮法、回流提取与膜分离技术等方法[14-15]。

表8 验证试验结果Tab.8 Results of verification tests

据文献资料查阅，王淑萍等应用正交试验法对南沙参多糖分离工艺进行了研究，张小倩等对应用响应面法设计对南沙参多糖进行回流提取方法及降解方法进行了优化研究[7-11]。《中国药典》2015版中南沙参的质量控制未涉及多糖含量检测[2]。本研究在前期工作基础上，应用单因素试验设计法对南沙参多糖进行回流法、煎煮法、超声提取法、微波提取法、超声辅助回流提取法和微波辅助回流提取法等提取方法、料液比、提取时间、提取温度、提取功率等因素进行优化，以提高南沙参多糖的提取得率。

结果显示，在提取功率为700 W，提取时间为85 min，料液比为1∶35(g/mL)，提取次数为1次时微波提取法对南沙参多糖的提取率显著高于其他提取方法与提取条件。当提取功率700～900 W、提取时间超过120 min时南沙参多糖提取率均呈下降趋势，这与张小倩等[13]的研究结果相似。可能是因为提取功率与提取时间的增加，较高温度条件下，提取时间过长，南沙参多糖发生降解，而导致多糖提取率下降造成。

本研究丰富了南沙参药材的研究资料，为南沙参药材与资源的充分利用与深入研究提供了一定参考。但在本研究中未对其他提取方法开展试验，下一步还需应用更先进科学的试验方法，对南沙参药材应用现代HPLC法、气相色谱法，结合药理药效学试验对南沙参进行进一步研究，为南沙参药材的开发应用提供更为全面、准确、科学的试验数据。