刘 涛，顾家镭，刘国坤，田中群

(1.厦门大学 化学化工学院，福建 厦门 361005；2.厦门大学 环境与生态学院，福建 厦门 361102)

化学战剂是一类剧毒化学物质，在战争时期常被用作化学武器对敌方人员进行大规模杀伤，由其引发的各类恐怖袭击事件也时有发生。化学战剂的种类众多，芥子气作为一种糜烂性化学战剂分子，其毒性极强，且化学性质稳定持久，会对人的呼吸道、皮肤造成长期损伤[1-2]。基于芥子气带来的恐怖威胁，实现该物质的灵敏、稳定现场快速检测具有重要现实意义。

目前，针对芥子气等化学战剂的快速检测技术主要有比色法、声表面波传感法、离子迁移谱法等。其中声表面波和离子迁移技术发展较为成熟，已经在实际快检中得到了应用。但这些方法只能进行初步的定性分析，缺乏高选择性，往往会造成检测结果的误判。表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)具有分子指纹图谱的高分辨率和近单分子水平的检测灵敏度两大优势，已成为表面科学和生命科学等前沿基础研究中的重要科研工具[3-5]。近年来，随着便携式乃至掌上型拉曼光谱仪的问世，SERS技术已被广泛用于食品安全和公共安全等实际应用领域，有望成为一种现场快速检测方法[6-7]。

基于SERS技术的芥子气检测方法已有相关报道：Van Duyne小组[8]利用纳米球光刻技术制备了一种沉积Ag膜的SERS基底，并在便携拉曼光谱仪上对芥子气模拟剂2-氯乙基乙基硫醚(2-CEES)进行了SERS检测；谢剑炜等[9]基于有孔Au@SiO2核壳型纳米粒子，在溶胶体系中建立了一种针对芥子气及其相关产物的现场检测分析方法。目前，SERS技术检测痕量化学战剂类分子的主要策略可分为两种。一种从提高分子有效检测浓度角度考虑：发展前处理方法，对待测物进行有效分离和浓缩富集。另一种则是通过提高SERS增强的灵敏度和选择性：(1)制备具有高电磁场增强能力的固态SERS基底，或在溶胶体系中加入各类酸碱盐形成具有丰富SERS热点的纳米聚集体；(2)通过SERS基底的表面化学修饰方法诱导待测分子靠近热点[10-13]。考虑到实际现场快速检测的需要，复杂的样品前处理已无法满足快速检测要求，而SERS基底表面的化学改性往往针对具有特定结构和官能团的某类分子，虽提高了特定目标物的检测灵敏度，但同时也降低了普适性，无法满足复杂多变的现场检测需求。

因此，本文从如何借助简单的静电相互作用提高目标分子在SERS基底的吸附能力这一关键因素出发，以芥子气模拟剂2-CEES为探针分子开展相关SERS检测研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

纳米溶胶消光光谱的采集于日本岛津公司生产的UV-2550紫外-可见光谱仪上完成；纳米溶胶的形貌和粒径分布则通过SEM(日本日立公司生产的S-4800场发射扫描电子显微镜)表征获得；分别以高分辨拉曼成像光谱仪RAMAN-11(日本Nanophoton公司)和i-Raman plus便携拉曼光谱仪(美国必达泰克公司)作为大型和便携式拉曼光谱仪代表进行SERS检测。

实验所用各类试剂均为分析纯及以上。2-氯乙基乙基硫醚(2-CEES)和盐酸羟胺均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,2-CEES分子质量为124.63，密度1.07 g/cm3；NaBr、NaF、NaCl、NaI、KCl、MgSO4以及柠檬酸钠、氯金酸均购自国药化学试剂有限公司。溶液配制和用水均采用法国Millpore公司生产的Milli-Q纯水仪提供的超纯水(电阻率≥18.2 MΩ·cm)。

1.2 金纳米粒子(Au NPs)的制备

1.2.1 15 nm Au NPs的制备取31.6 mL水置于100 mL圆底烧瓶中，加入390 μL 1%(质量分数)的氯金酸溶液，剧烈搅拌下加热至沸。5 min后，迅速加入1 280 μL 1%(质量分数，下同)的柠檬酸钠溶液。0.5 h后，溶液由透明逐渐转黑并缓慢变红，最终得到亮酒红色的Au NPs溶胶溶液。

1.2.2 50 nm Au NPs的制备将35 mL水、2 mL 1%柠檬酸钠溶液、500 μL 0.1 mol/L 盐酸羟胺溶液以及2.5 mL 15 nm Au NPs溶胶混合均匀后，在剧烈搅拌下缓慢滴加15 mL 0.042% 的氯金酸溶液(15 mL/h)，待反应完全后制得(50±5) nm的Au NPs。最后，将该金纳米溶胶在4 500 r/min转速下离心10 min除去溶液中过多的柠檬酸钠，并加入等量超纯水，于低温密封保存备用。

1.3 2-CEES标准溶液的配制

取93.4 μL 2-CEES溶解在100 mL纯水中得到1 000 mg/L的标准溶液，完全混合摇匀后用超纯水逐级稀释，得到不同浓度的标准溶液，低温密封保存。

1.4 消光光谱及SERS光谱的获得

取2 mL Au NPs溶胶加入洁净石英比色皿中，加入1 mL超纯水稀释后于紫外-可见光谱仪上进行测试。

取1.5 mL 50 nm Au NPs溶胶离心(转速4 500 r/min)10 min，去除上清液并于96孔板中定容至150 μL，依次加入50 μL待测物溶液和50 μL无机盐团聚剂，混合均匀后立即进行SERS检测。

2 结果与讨论

2.1 Au NPs的均匀性、稳定性及重复性

由50 nm Au NPs的消光光谱(图1A)可知，该NPs的局域表面等离激元共振(LSPR)峰位位于529 nm，半峰宽约为50 nm。与传统一步法[14]得到的相似粒径Au NPs相比，本工作得到的Au NPs的半峰宽明显变窄，说明粒径分布均一性更佳。SEM图(图1B)显示所制备的Au NPs呈现近球形，表面分布一些不规则晶面；与之相应的粒径分布统计柱状图(插图)表明Au NPs的平均粒径为(50±5) nm。

图1 Au NPs的消光光谱图(A)及SEM图(B)Fig.1 Extinction spectrum(A) and SEM image(B) of Au NPs colloid insert：the related size distribution histogram

SERS检测的稳定性和重复性是实现其实际应用的必要环节，这两个参数主要依赖于SERS增强基底的稳定性和批间重复性。本研究首先测试了同一批次Au NPs的消光光谱图，通过分析不同存储时间点下各批次LSPR吸收峰位置的变化判断Au NPs的稳定性，并根据不同批次Au NPs的消光光谱图，统计了各批次LSPR吸收峰的位置。

图2A为3个月存储期内，4 ℃低温条件下密封保存的Au NPs的消光光谱图。由图可知，存储期内，Au NPs的LSPR吸收峰位置仅在528～530 nm范围内波动(图2A插图)，其光学性能稳定性主要是来自于Au NPs表面吸附的负电性柠檬酸根及其氧化产物的保护作用(Zeta电位≅-30 mV)。该结果表明3个月内，Au NPs的稳定性良好。进一步考察了9个批次Au NPs的消光光谱图(图2B)，根据图2B插图可知，LSPR吸收峰均处于528～530 nm范围内，峰位置的波动范围仅为±1 nm，表明Au NPs的批次间重现性良好。良好的稳定性和重现性为SERS检测及潜在实际应用奠定了可行性基础。

图2 Au NPs随保存时间(A)和批次(B)变化的消光光谱图Fig.2 Storage time(A) and parallel preparation batch(B) dependent extinction spectra of Au NPs colloidinsert：the corresponding fluctuated SPR peak position

2.2 模拟剂2-CEES的常规拉曼测试及谱峰指认

与两端都是氯乙基的芥子气相比，一端是氯乙基一端是乙基的2-CEES(分子结构式如图3插图所示)保留了芥子气基本的化学性质，同时其生理毒性显著降低，因此常作为芥子气模拟剂进行相关检测研究。图3为532 nm激光激发下2-CEES的常规拉曼光谱，可明显观察到位于653、699、753 cm-1处的特征峰。其中653 cm-1处的峰来自于C—S—C的拉伸振动模式，699、753 cm-1处的峰则分别对应于C—Cl的对称和非对称拉伸模式，同时包含C—S—C和C—H拉伸振动模式。975、1 038、1 054 cm-1处的峰来自于C—C的拉伸振动模式，1 290 cm-1处为C—H的弯曲振动模式。其中，位于600～800 cm-1区间的3个拉曼特征峰被视为芥子气及其模拟剂的特征指纹谱峰，常被用于芥子气及其模拟剂的定性识别[15-16]。

图3 2-CEES液体的常规拉曼光谱Fig.3 Normal Raman spectra of 2-CEES liquid

2.3 模拟剂2-CEES的水解过程

在水溶液中，芥子气及其模拟剂分子2-CEES不稳定，很容易发生水解。如图4A所示，含孤对电子的硫原子首先与氯原子发生分子内亲核取代反应生成带正电的硫离子中间体，在此基础上进一步水解成乙基，2-羟基乙基硫醚[17]。其中，硫离子具有强亲电性，极易与生物大分子中强亲核性的富电子原子发生反应，共价结合形成不可逆的烃化产物，该过程正是芥子气分子的毒理学生理机制。

当将新鲜制备的150 μL微量(>10 mg/L)的2-CEES水溶液与50 μL Au NPs溶液混合时，Au NPs颜色迅速由酒红色变为黑色，说明Au NPs发生了明显的团聚，如图4B插图所示。该现象表明模拟剂在水中的水解速度较快，其中间体(正电性硫离子)通过形成Au—S键强吸附于负电性的Au NPs表面[18]，微量浓度水平的2-CEES即可破坏Au NPs溶胶的稳定界面双电层，诱导其团聚形成SERS热点，实现2-CEES的检测。从图4B可观察到位于615、636、1 050 cm-1处的2-CEES特征拉曼谱峰。

图4 2-CEES的水解过程和中间产物(A)及10 mg/L 2-CEES与Au NPs溶胶混合前后的SERS谱图及其团聚状态照片(插图)(B)Fig.4 Hydrolysis of 2-CEES and the corresponding intermediates at different stages(A)and SERS spectra obtained before and after the addition of 2-CEES into Au NPs colloid(B)insert：the corresponding aggregation states

为了获得更高的检测灵敏度，实现从微量到痕量2-CEES的高灵敏检测，考察了无机盐团聚剂对提高2-CEES检测灵敏度的作用。

2.4 模拟剂2-CEES的SERS检测

由前期研究可知，在溶胶体系中，无机盐常作为团聚剂破坏胶体双电层，使胶体团聚，从而构筑SERS热点实现目标物的痕量检测。目标分子和团聚剂(无机盐)的阴、阳离子在SERS基底表面的竞争和共吸附行为决定了该分子能否被高灵敏检出[19]。

图5 10 μg/L 2-CEES的SERS谱图随团聚剂种类(A)和NaBr浓度(B)的变化趋势，以及以0.3 mol/L NaBr为团聚剂时SERS谱图对2-CEES浓度的依赖性(C)Fig.5 The agglomerating agents(A) and NaBr concentration(B) dependent SERS spectra of 10 μg/L 2-CEES,and 2-CEES concentration dependent SERS spectra with 0.3 mol/L NaBr as agglomerating agent(C)

择优选择NaBr作为团聚剂，考察了2-CEES的SERS谱图随NaBr浓度的变化情况，结果如图5B所示。位于610 cm-1的2-CEES拉曼特征峰强度并未出现明显变化，说明在0.3～3.0 mol/L浓度范围内，Br-与2-CEES在Au NPs表面的竞争共吸附行为未发生显著变化，因此选用0.3 mol/L NaBr作为团聚剂。以Au NPs溶胶为SERS基底，其SERS谱图随2-CEES质量浓度的变化如图5C所示。参考空白对比610 cm-1附近的特征峰强度可知，该条件下，2-CEES的最低可检出质量浓度为10 μg/L水平。

考虑到化学战剂现场检测的实际情况和需求，基于上述工作，本研究在便携式拉曼光谱仪上进行相关测试。如图6A所示，对照金溶胶空白信号谱图，在2-CEES 为0.1 mg/L时，610 cm-1附近的拉曼特征峰陡增，0.01、0.001 mg/L条件下可以观察到640 cm-1处微弱拉曼峰的产生；1 000 mg/L时 610 cm-1处的峰强度减弱且640 cm-1处出现较强拉曼峰；在此过程中，位于1 050 cm-1处谱峰的强度随2-CEES浓度的增加而不断增强。以位于1 050 cm-1处的特征SERS谱峰为例，考察2-CEES的SERS谱峰强度随质量浓度的变化关系，所得结果如图6B所示。由图可知，1 050 cm-1处拉曼峰强度随2-CEES浓度的升高先增强后趋于平缓。采用Langmuir 方程对该趋势进行拟合，获得r2=0.997的良好效果，说明：(1)峰强随浓度的变化符合Langmuir吸附等温模型；(2)所研究浓度范围内，2-CEES可能直接吸附于表面且未达到满单层。位于610 、640 cm-1的两个SERS谱峰的先后出现和拉曼峰相对峰强的变化可能意味着在Au NPs表面存在两种不同吸附构型的2-CEES分子，具体尚有待于更深入的理论计算和实验分析。

图6 采用便携式拉曼光谱仪，2-CEES浓度调控下的SERS谱图(A)和1 050 cm-1处的归一化拉曼峰强度的变化趋势(B)Fig.6 Facilitated by a portable Raman spectrometer, the 2-CEES concentration dependent SERS spectra (A)and normalized Raman intensities of the 1 050 cm-1 peak(B)

对比图5C和图6A可知：便携式拉曼和大型拉曼上得到的2-CEES的SERS谱图和灵敏度基本一致，均在610 cm-1附近和1 050 cm-1出现了该分子的特征SERS峰；可稳定获得10 μg/L水平的检出浓度。该对比充分展示了SERS技术有望成为一种可对芥子气进行高灵敏准确定性和半定量分析的现场分析手段。

3 结 论

本文制备了尺寸均匀、重复性佳和稳定性好的50 nm球形金纳米粒子溶胶，以其为SERS增强基底，实现了对化学战剂芥子气模拟剂分子2-CEES的定性和半定量分析，获得了μg/L级别的高灵敏准确定性检出。本工作验证了SERS技术用于芥子气模拟剂快检的可行性，为军事上化学武器类毒剂分子的现场快速检测提供了一种可靠的参考途径。