胡骏杰，刘 飞，马文俊，上官国强*

(1.济宁医学院 司法鉴定中心，山东 济宁 272067；2.济宁医学院 法医学与医学检验学院，山东 济宁 272067；3.南京大学 化学化工学院，生命分析化学国家重点实验室，江苏 南京 210023)

苯二氮卓类药物(Benzodiazepines,BZDs)是一类中枢神经系统药物，具有镇静、安眠、抗焦虑、抗惊厥等功效[1-2]，因其疗效好、毒性小，近年来已成为临床应用最为广泛的安眠镇静药物[3]。根据半衰期长短，苯二氮卓类药物可分为3类：短效类(咪达唑仑等)、中效类(劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑等)及长效类(地西泮、硝西泮、氟硝西泮、氯硝西泮等)。然而，作为一类受到严格管控的精神类药物，苯二氮卓类药物的过量使用、长期使用或多种药物混用均会引起中毒，导致昏迷、血压下降、呼吸循环抑制甚至死亡[4]。据文献报道，临床上滥用该类药物自杀的病例较常见[5]；近年来也被犯罪分子用于麻醉抢劫、强奸，导致被害人药物中毒、身心受到残害[6]。因此，建立准确、简便的苯二氮卓类药物分析方法，迅速判断中毒药物，并通过血药浓度评估病情，对患者病情的确诊极其重要。

血液中苯二氮卓类药物的检测方法主要包括气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[7-9]及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[10-13]，相较而言，LC-MS/MS法具有更高的分析通量及更强的定量检测能力[7-8]。相关标准方法中[14]，血液样品的前处理使用有机溶剂液液萃取法，实验操作步骤繁琐；且LC-MS/MS分析中仅采用多反应监测(MRM)模式，痕量物质确证困难。基于此，本研究对血液样品的前处理步骤进行了简化；并借助三重四极杆-线性离子阱(QTRAP)复合型质谱系统的优势[15-16]，选取临床中具有代表性的8种不同类别的常用苯二氮卓类药物作为研究对象，建立了高效液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱(QTRAP HPLC-MS/MS)检测方法，采用分段多反应监测-信息依赖性采集-增强离子扫描(sMRM-IDA-EPI)模式分析，结合EPI二级谱库检索对血液样本中8种苯二氮卓类药物进行确证，依据sMRM数据进行外标法定量分析。该方法操作简便，结果可靠，可为拯救生命赢得宝贵时间，同时也为急救医疗、中毒检测等领域提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SCIEX QTRAP®5500超高效液相色谱-串联质谱仪(美国AB SCIEX公司)；5804R型高速离心机(德国艾本德股份公司)。

地西泮、硝西泮、氯硝西泮、氟硝西泮、劳拉西泮、阿普唑仑、艾司唑仑、咪达唑仑标准品(美国Cerilliant标准物质公司，均为1.000 mg/mL甲醇溶液)；乙酸铵(质谱级，美国Fluka公司)、甲酸、甲醇及乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；实验用水为超纯水。空白血液由健康志愿者提供，置于-20 ℃冰箱密封保存。

1.2 标准溶液的配制

以移液器分别移取10 μL质量浓度为1.000 mg/mL的地西泮等8种苯二氮卓类药物标准品至10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配制质量浓度为1.0 μg/mL的混合标准储备液，置于-20 ℃冰箱保存，有效期为6个月。

准确吸取一定体积的上述混合标准储备液于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配制质量浓度分别为5.0、10、20、50、100、200、500 ng/mL的混合标准工作液，置于4 ℃冰箱保存，有效期为7 d。

1.3 血样前处理

有机溶剂液液萃取法：精密吸取500 μL血样置于离心管中，加入1.0 mL硼酸缓冲液(pH 9.2)，用2.0 mL乙醚提取，涡旋混匀后，以10 000 r/min离心5 min。上清液于60 ℃水浴挥干，残余物以500 μL甲醇复溶，过0.22 μm有机相滤膜后，进行HPLC-MS/MS分析。

甲醇沉淀蛋白法：精密吸取500 μL血样置于离心管中，加入1.0 mL甲醇，涡旋混匀，以10 000 r/min离心5 min，吸取上清液，过0.22 μm有机相滤膜后，进行HPLC-MS/MS分析。

乙腈沉淀蛋白法：精密吸取500 μL血样置于离心管中，加入1.0 mL乙腈，涡旋混匀，以10 000 r/min离心5 min，吸取上清液，过0.22 μm有机相滤膜后，进行HPLC-MS/MS分析。

1.4 实验条件

色谱条件：Phenomenex Kinetex®Biphenyl(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)色谱柱；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液；B为甲醇；流速：0.5 mL/min；进样量：2 μL；柱温：40 ℃；梯度洗脱程序：0～1.0 min,5%B；1.0～1.5 min,5%～20%B;1.5～9.0 min,20%～95%B;9.0～11.0 min,95%B；11.0～11.1 min,95%～5%B;11.1～14.0 min,5%B。

质谱条件：离子源：电喷雾源(ESI+)；扫描方式：sMRM-IDA-EPI；离子源电压(IS)：5 500 V；离子源温度：500 ℃。8种苯二氮卓类药物的MRM参数及色谱保留时间见表1。

表1 8种苯二氮卓类药物的MS/MS采集参数及保留时间Table 1 MS/MS acquisition parameters and retention times of 8 benzodiazepines

2 结果与讨论

2.1 质谱扫描模式的选择

本研究基于高效液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱技术，采用sMRM-IDA-EPI扫描模式，实现血液样本中8种苯二氮卓类药物的快速确证与定量分析。将分段扫描模式Scheduled MRM检测窗口时间设为60 s，可在保留时间附近锁定并捕捉目标物信号，提高色谱峰的响应值；sMRM作为IDA预扫描，还可触发EPI扫描。相比于单纯三重四极杆质谱，QTRAP复合型质谱可使二级碎片在离子阱中富集，以获取目标化合物高灵敏的二级质谱信息，通过进一步与所建EPI谱库检索匹配，可迅速确证检出物，显著提高定性分析结果的可信度。

2.2 EPI谱库的构建与检索

分别在低(20 eV)、中(35 eV)、高(50 eV)3种碰撞能量下，对8种苯二氮卓类药物标准品进行EPI扫描，构建EPI二级谱库，并记录目标化合物的离子碎片特征信息。实际血样采用sMRM-IDA-EPI模式扫描并获取检出物的EPI二级谱图，进行EPI谱库检索匹配，以比对结果中的匹配度值(Fit值)。Fit值反映检出可疑物质与标准物质谱图的相似度，其值越高，则匹配度越高。

2.3 液相色谱条件的优化

2.3.1 色谱柱的选择考察了Phenomenex Kinetex®Biphenyl(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)与Venusil MP C18(100 mm×2.1 mm，3 μm)两种不同固定相官能团的色谱柱对8种目标化合物的分离效果。结果表明，由于苯二氮卓类药物具有苯环与含氮杂环结构，基于π-π相互作用与疏水相互作用双重作用力，其在Biphenyl(双苯基)柱上的保留、分离效果和色谱峰形均优于C18色谱柱，因此实验采用Biphenyl色谱柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)分析目标化合物。

2.3.2 流动相的选择以0.1%甲酸水溶液作为水相，实验考察了分别以甲醇与乙腈作为有机相时对8种苯二氮卓类药物分离效果的影响。结果显示，在“1.4”所述梯度洗脱程序下，甲醇作为有机相时8种目标化合物的分离效果更好。因此以甲醇为有机相，进一步考察了0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸水溶液-5 mmol/L乙酸铵对分离效果的影响，结果表明，水相中含乙酸铵时，目标分析物的峰形得到明显改善，其峰宽更窄(均在15 s内)，且峰形更对称。基于以上结果，确定采用甲醇与0.1%甲酸水溶液-5 mmol/L乙酸铵作为流动相。在优化条件下，8种苯二氮卓类药物空白血液基质加标溶液的提取离子流色谱图见图1，各化合物的保留时间见表1。虽然部分化合物的提取离子色谱峰重叠，但液相色谱-串联质谱技术主要以目标物特征离子对的丰度比及峰面积作为定性、定量依据，具有高度专属性，因此分离度对苯二氮卓类药物的定性及定量分析结果不会造成影响。此外，本实验采用全梯度洗脱，优化后的液相色谱条件可扩展应用于更多类型毒物的筛查，且可保证分析灵敏度和准确性，具有很好的适用性和较高的分析效率。

图1 空白血液基质添加8种苯二氮卓类药物(10 ng/mL)的提取离子流色谱图Fig.1 Extracted ion chromatogram of 8 benzodiazepines(10 ng/mL) spiked in blank blood matrix

2.4 血样前处理方法的优化

实验考察了有机溶剂液液萃取法、甲醇沉淀蛋白法和乙腈沉淀蛋白法对低(1.0 ng/mL)、中(5.0 ng/mL)、高(20 ng/mL)质量浓度混合标准加标血样中目标分析物的提取效果，8种苯二氮卓类药物的平均回收率范围见表2。结果显示，有机溶剂液液萃取法和乙腈沉淀蛋白法对血样中蛋白质等复杂成分的净化效果优于甲醇沉淀蛋白法，目标分析物具有较高的回收率。相比于有机溶剂液液萃取法，乙腈沉淀蛋白法的操作更快捷简便，因而选取该方法处理血液样品。

表2 不同前处理方法下血样中8种苯二氮卓类药物的平均回收率(n=6)Table 2 Average recoveries of 8 benzodiazepines in blood samples with different pre-treatment methods(n=6)

2.5 方法性能指标

2.5.1 线性方程、检出限与定量下限吸取450 μL空白血液与50 μL系列质量浓度的混合标准工作液，涡旋混匀，分别制成含8种苯二氮卓类药物质量浓度为0.5～50 ng/mL的标准血样，按“1.3”所述乙腈沉淀蛋白法处理血样，并进行HPLC-MS/MS分析。分别以8种苯二氮卓类药物定量离子对的峰面积(y)对其质量浓度(x,ng/mL)作图并进行线性回归分析，结果显示，各化合物在0.5～50 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数(r)均大于0.998。取0.5 ng/mL的上述标准血样逐级稀释，采用本方法进行测定，得到8种苯二氮卓类药物的检出限(LOD,S/N≥3)为0.01～0.10 ng/mL，定量下限(LOQ,S/N≥10)为0.10～0.25 ng/mL(表3)。

表3 8种苯二氮卓类药物在血液中的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量下限Table 3 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantitation of 8 benzodiazepines in blood

2.5.2 回收率、基质效应与相对标准偏差分别在空白血样中添加低、中、高浓度的混合标准工作液，配制成8种苯二氮卓类药物质量浓度分别为1.0、5.0、20 ng/mL的加标血样，各浓度设置6个平行，按本方法进行测定，并以提取加标血样与相应浓度混合标准溶液中对应化合物的定量离子对峰面积之比计算基质效应。如表4所示，8种苯二氮卓类药物在血液中的基质效应为79.8%～97.2%，说明基质对实验结果影响不大，本方法采用基质匹配溶液定量以进一步减小误差;各物质的回收率为79.3%～112%，相对标准偏差(RSD)为4.3%～11%。

表4 8种苯二氮卓类药物在血液中的基质效应、平均回收率与相对标准偏差(n=6)Table 4 Matrix effects,average recoveries and relative standard deviations(RSD) of 8 benzodiazepines in blood(n=6)

2.6 实际样本检测

2020年11月，某医院送检急诊疑似苯二氮卓类药物中毒患者的血液样本1份。采用本方法筛查血液样本并进行HPLC-MS/MS分析，获取MRM谱图及EPI二级谱图。结果显示，该样本中检出可疑物质地西泮、阿普唑仑及咪达唑仑，各物质的提取离子流色谱图见图2；进一步将样品EPI谱图在构建谱库中检索匹配，显示检出物质与地西泮、阿普唑仑及咪达唑仑的标准谱图具有高度一致性，匹配值分别为93.52、94.66及91.87。因此，判断该样本中检出地西泮、阿普唑仑及咪达唑仑。利用原样本及稀释20倍后进样的MRM数据进行定量分析，检出地西泮、阿普唑仑及咪达唑仑的质量浓度分别为30.57、6.51、686.9 ng/mL。

图2 血液样本中3种可疑检出物的提取离子流色谱图Fig.2 Extracted ion chromatograms of the suspicious detected compounds in blood sample

3 结 论

对于苯二氮卓类药物的HPLC-MS/MS分析，目前国际上多采取固相萃取[3,9]、液液萃取及QuEChERS等方法[4]处理生物样品，并结合目标分析物的氘代同位素内标实现定量分析[3-4,8-9,11]。本研究基于超高效液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱技术，建立了血液样本中8种苯二氮卓类药物的快速确证与检测方法。采用乙腈沉淀蛋白法处理血液样本，相比于传统有机溶剂液液萃取法，简化了操作步骤，有效缩短了实验时间；应用sMRM-IDA-EPI扫描模式，结合谱库检索确证检出物信息，增强了定性分析结果的可信度；以外标法定量，结果直观灵敏。虽然该方法在定量准确度方面可能有所欠缺，但实验步骤简便，实验成本低，定性分析结果可信度高，特别适用于医疗抢救中可疑中毒样本相关物质的快速筛查及大致定量，辅助医护急救人员对病情迅速确诊及评估。此外，还可通过逐步完善EPI谱库，将其推广应用至血液中更多种药物毒物的快速确证及检测，为医疗急救、临床治疗等提供技术支持。