赵卫平，李 婵，洪 金，林鹏飞,*，雷颖虎,*

(1.秦岭大熊猫研究中心，陕西 周至 710402；2.西北农林科技大学)

大熊猫是我国特有珍稀动物，冠有国宝美称，尽管被划分为国家一级保护动物，其数量却仍然增长缓慢。除了人为因素的影响，这还与其独特的生理繁殖机制有关，大熊猫是单季节发情动物，发情时间短，仅有1～3 d，如何精准判断大熊猫的发情期是提升大熊猫繁殖率的最关键一步。孕酮(Progesterone，P4)和雌激素(Estrogen)做为雌性动物发情时变化最为剧烈的两种激素，且在动物尿液中就可检测到，因此可作为大熊猫无侵入损害的一个检测指标。

目前ELISA检测技术已大量应用于激素检测，HRP是ELISA试剂盒显色体系的主要成分之一，其与抗原或者抗体结合可以形成酶标抗原或酶标抗体从而应用于ELISA试剂盒中。P4为半抗原，化学结构相对稳定，不能与HRP直接结合，需要用11α-OH-P4进行化学修饰后与HRP结合，因此本试验旨在合成用于孕酮检测的ELISA试剂盒的辣根过氧化物酶酶标的P4-HRP偶联物，为后续开发大熊猫孕酮ELISA检测试剂盒提供所需的酶标抗原。

1 材料与方法

表1 试剂及耗材

1.2 主要仪器

表2 试验用仪器

1.3 方法

1.3.1 孕酮-半琥珀酸酯的合成 ①称取5 g 11α-羟基孕酮(11α-OH-P

4)、5.96 g 琥珀酸酐与2.6 g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)于圆底烧瓶中，加入200 mL二氯甲烷，搅拌回流反应5 ～10 h；②薄层色谱反应(Thin layer chromatography，TLC)同时进行跟踪反应进度，展开剂为V乙酸乙酯：V石油醚=10∶1；③待反应完全后，将反应液用60 mL二氯甲烷稀释；④纯化：反应液用10 mL去离子水萃取1次，10 mL 2 M 盐酸萃取2次，最后用去离子水萃取2次；⑤干燥脱色：加入无水硫酸钠干燥，活性炭室温搅拌脱色，过滤得无色澄明液，减压蒸尽二氯甲烷，干燥得到白色结晶产物，即为11α-羟基半琥珀酸酯(11α-OH-P4-HS)。……